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导语 
使用 ProTox 3.0 评估了 PET-MP 的毒性特征，该毒性预测了广泛的器官特异性毒性，包括呼吸、肝脏、神经、生态和免疫学影响。分子起始事件与乙酰胆碱酯酶（AChE）、红藻酸受体（KAR）、兰尼苷受体（RYR）和组成型雄甾烷受体密切相关，提示存在肺组织损伤的风险（ 图 1）。基于这些发现，采用网络毒理学分析阐明了 PET-MPs 在促进 IPF 发展中的作用。
图 1.A. PET-MP 的分子式和毒性分布;（乙、丙）PET-MP 中的毒性分布。
通过 SwissTargetPrediction 和 ChEMBL 数据库共确定了 120 个与 PET-MP 相关的候选靶点，从而深入了解与 IPF 有关的可能分子途径。分析来自 GEO 数据库 （GSE110147） 的转录组数据，以比较 IPF 患者和健康对照之间的基因表达谱。PCA 显示两组之间存在明显的聚类，PC1 和 PC2 分别占总方差的 43.48%和 8.19%（ 图 2A），突出了显着的分子差异。火山图鉴定出 17,612 个差异表达基因，包括 IPF 样本中 6770 个上调基因和 10,842 个下调基因（ 图 2B）。小提琴图进一步证实了 IPF 组中更异质的表达模式（ 图 2C，D）。表达变化最大的前 20 个基因的热图强调了组间不同的转录谱（ 图 2F）。为了将分子变化与 PET-MPs 暴露联系起来，进行了 Venny 分析，将 PET-MP 相关靶标与 IPF 相关差异表达基因相交，产生 81 个交集基因（ 图 2E）。尽管与差异表达基因的总数相比，交集基因的数量相对较少，但它们在功能相关途径中的潜在富集提供了对 PET-MP 可能有助于 IPF 发病机制的分子机制的定性见解。正如随后的功能富集所证实的那样，这些基因是与疾病相关的生物过程的核心。
图 2.PET-MP 诱导的 IPF 靶标鉴定。（A）PCA 分析;（B）火山图;（C、D）小提琴情节;（E） 热力图;（F） 维恩图。
为了进一步阐明与交集基因相关的功能和信号通路，使用 DAVID 对人类基因集进行了 GO 和 KEGG 富集分析（Sherman 等人，2024 年）。GO 分析鉴定出 191 个显著富集的术语，包括 106 个生物过程（BP）、15 个细胞成分（CC）和 70 个分子功能（MF）。对每个类别中的 20 个最重要的术语进行优先级排序和可视化（ 图 3A-C）。这些结果表明，PET-MP 靶点在环氧合酶 P450 通路、异生素代谢过程和类固醇代谢过程等关键 BP 中高度富集。在 CC 方面，在细胞内膜结合细胞器、内源性膜和细胞质中观察到富集，表明其在细胞器活性和膜动力学中起重要作用。对于 MFs，PET-MP 靶标主要参与单加氧酶活性、血红素结合、铁离子结合和芳香化酶活性。KEGG 通路分析进一步查明了几种与 IPF 相关的信号通路，包括代谢和脂质代谢通路、动脉粥样硬化信号传导、C 型凝集素受体级联反应、化学致癌和活性氧介导的过程（ 图 3D）。这些发现共同表明，PET-MPs 可能通过调节这些关键的生物学途径参与 IPF 的发展。
图 3.GO 和 KEGG 功能富集分析。（A） 生物过程;（B） 细胞成分;（C）分子功能。
将交集的靶标提交给 STRING 以构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，然后使用 Cytoscape v3.10.3 进行可视化（ 图 4A）。CytoHubba 分析根据程度、接近度、介于间性和最大集团中心性对前 20 个枢纽基因进行排名，节点颜色强度反映了中心性得分——较亮的节点表示较高的中心性，而较暗的节点对应于较低的中心性（ 图 4B-F）。多种算法一致地将 AKT1 识别为网络内的关键枢纽基因。随后使用 81 个交集基因作为暴露变量和 IPF 作为结果变量进行孟德尔随机化 （MR） 分析。结果表明，PIK3CD（OR = 0.997）和 PIM1（OR = 0.9994）是 IPF 的保护因素，而 AKT1（OR = 1.0007）是危险因素（ 图 4G）。显着的 P 值 （< 0.05） 证实了这些指标与 IPF 之间存在很强的因果关系，没有异质性或多效性的证据。
图 4.交叉基因和枢纽基因筛选的网络图。（A）交叉基因网络图;（B）筛选出 BottleNeck 的前 20 个核心靶点;（C）Closeness 筛选的前 20 个核心目标;（D）偏心率筛选的前 20 个核心靶点;（E）EPC 筛选前 20 大核心靶点;（F）跨国公司筛选的前 20 个核心目标。颜色越深表示排名越高。（G）孟德尔随机化（MR）分析结果。
为了进一步表征 PET-MPs 与 MR 验证的靶蛋白之间的相互作用效率，进行了分子对接研究。所有三种靶蛋白在与 PET-MP 的相互作用中均表现出低于-5.0 kcal/mol 的结合能，表明具有很强的结合亲和力（ 图 5）。具体而言，AKT1 受体上的残基 GLN43、PRO42、ARG41、GLN47、GLU40、TYR38、LYS39、PRO51 和 LEU52 与 PET-MP 形成范德华相互作用，而 ALA50 形成碳氢键（ 图 5A）。在 PIK3CD 受体上，残基 CYS815，PHE609 和 LEU613 与 PET-MP 建立了氢键，并具有额外的范德华和碳氢相互作用，涉及 LEU791，TYR813，GLY814，GLN795，GLN610，LEU612，PHE646，HIS650，GLN792，PRO812 和 MET788（ 图 5B）。对于 PIM1，GLU121 和 LYS67 形成氢键;GLY50、LEU44、ILE104、VAL126、PRO123、ARG122、LEU120 和 ASP186 形成范德华相互作用;15-羟基前列腺素脱氢酶（HPGD）上的 LEU174，ILE185，VAL52 和 ALA65 残基与 PET-MP 建立了疏水相互作用（ 图 5C）。这些结果证实了 PET-MP 结合并可能调节这些关键蛋白质功能的强大潜力。
图 5.PET 和靶蛋白分子的对接结果。（A）PET 与 AKT1 的对接;（B）PET 与 PIK3CD 的对接;（C）PET 与 PIM1 的对接。该图表示 PET 分子在每个蛋白质表面空腔中的结合位置以及与残基的相互作用。
采用分子动力学模拟评估 PET-MP 复合物与 PIM1、AKT1 和 PIK3CD 的稳定性。PIM1-PET 和 AKT1-PET（2.3–2.4 Å）的均方根偏差轨迹稳定在 20 ns 内，而 PIK3CD-PET 保持在 5.2 Å以下，80 ns 后仅略有增加（ 图 6A）。回转半径（Rg）和溶剂可及的表面积迹线显示出最小的膨胀或收缩[ 图 6B，C]，氢键计数保持不变，表明持续的分子接触（ 图 6D）。低于 6 Å的均方根波动值表明主链流动性和刚性复合物形成有限（ 图 6E）。详细的相互作用图谱揭示了几种稳定的接触：在 AKT1-PET、PRO51、GLU40、GLN47 和 LEU52（范德华）、ALA50 和 TYR38（氢键）以及 LYS39（烷基相互作用）中;在 PIK3CD-PET、LEU735、LYS642、PRO812 和 GLN170（氢键）中;以及 PIM1-PET、ALA65 和 LEU174（范德华）、SER46、GLY50、GLY48、GLY47（碳-氢键）和 VAL52（烷基相互作用）。总的来说，这些模拟表明，PET-MP 在整个模拟期间与所有三种靶蛋白形成稳定且结构保守的复合物（ 图 6 E）。
图 6.蛋白质-配体复合物的分子动力学模拟。（A）蛋白质-配体复合物随时间变化的 RMSD 值;（B）蛋白质-配体复合物随时间变化的 Rg 值;（C）蛋白质-配体复合物随时间变化的 SASA 值;（D）蛋白质-配体复合物随时间变化的 HBonds 值;（E）蛋白质-配体复合物氨基酸骨架原子随时间变化的 RMS 值和结合自由能的景观形貌。
IPF 肺组织的单细胞 RNA 测序鉴定了多种细胞群，包括增殖的树突状细胞、单核细胞、M2 和 M1 巨噬细胞、浆细胞、俱乐部细胞、肺泡 2 型（AT2）细胞和肺泡 1 型（AT1）细胞（ 图 7A）。靶基因表达分析显示，PIK3CD 主要富集在 CD8+ T 细胞中，在 IPF 组中表达显著降低（ 图 7B），表明主要通过 CD8+ T 细胞发挥保护作用。AKT1 主要在 AT1 和 AT2 细胞中表达（ 图 7C）。PIM1 在成纤维细胞中表现为主要表达，在 IPF 样本中表达明显降低，表明其参与了疾病相关的成纤维细胞功能障碍。因此，恢复 PIM1 活性可以提供一种减轻 IPF 进展的治疗策略（ 图 7D）。热图分析进一步表明，在 AT2 和 CD8+ T 细胞中，PIK3CD 和 PIM1 表现出与 AKT1 相反的趋势，这意味着这两种细胞类型可能在微塑料促进 IPF 的机制中发挥着特别关键的作用（ 图 7E）。
图 7.单细胞 RNA 测序的定位分析。（A）对照组和 IPF 组细胞成分的比较;（B）AKT1 的富集和表达;（C）PIK3CD 的富集和表达;（D）PIM1 的富集和表达;（E）同一细胞中三个基因的富集和表达。
总结
通过整合多个数据库、构建 PPI 网络和进行孟德尔随机分析，本研究确定了在 IPF 发病机制中起关键调控作用的 3 个核心靶点：AKT1、PIK3CD 和 PIM1。其中，AKT1 是危险因素，而 PIK3CD 和 PIM1 可能具有保护作用。功能富集分析（包括 GO 和 KEGG）表明，PET-MPs 可能通过调节与代谢过程有关的关键蛋白，特别是脂质代谢和动脉粥样硬化，促进 IPF 的发生和发展。分子对接结合分子动力学模拟验证了 3 种靶蛋白与 PET-MPs 之间的稳定结合关系。单细胞测序分析进一步表明，CD8⁺T 细胞和 II 型肺泡上皮细胞（AT2）可能是 PET-MPs 在 IPF 中发挥作用的重要靶细胞。
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