结果：3.1. MC 暴露诱导大鼠肾损伤和纤维化为了评估 MC 暴露对肾损伤的影响，大鼠口服 MC4 周。组织病理学分析，包括HE 染色和 Masson 三色染色，显示与对照组相比，MC 组的肾脏损伤显着 [ 图 1A 和 1B]。MC 处理的肾脏表现出显着的形态变化，例如金棕色晶体的存在，肾小管上皮细胞损伤， 炎症细胞浸润和间质水肿（ 图 1A）。此外，Masson 染色突出显示纤维化增加，其特征是肾小管周围和间质中存在蓝色纤维网（ 图 1B）。进一步分析肾脏重量以及 Scr 和 BUN 水平显示， 与对照组相比，MC 组显着增加，表明代偿性肾肥大和肾功能受损（ 图 1C）。为了进一步阐明 MC 诱导的肾损伤和纤维化的分子机制，进行了 WB 分析（Chen 等人，2023 年）。 结果表明，MC 组肾损伤和纤维化的关键标志物，包括 FN、 波形蛋白 、Kim-1、NGAL、Clu、Tff3 和 Opn 显着上调 （ 图 1D）。这些发现共同表明，MC 暴露可诱发严重的肾损伤和纤维化。图 1.MC 暴露诱发肾损伤。（A）MC 暴露 4 周后大鼠肾脏的 HE 染色（比例尺= 400μm）。（B）MC 暴露 4 周后大鼠肾脏的马塞翁染色（比例尺= 400μm）。（C）条形图显示两组之间体重以及 Scr 和 BUN 浓度的比较。（D）MC 共曝后 FN，波形蛋白，Kim-1，NGAL，Clu，Tff3 和 Opn 蛋白的蛋白质印迹。以 GAPDH 为参比蛋白。条形图显示了两组之间 FN、波形蛋白、Kim-1、NGAL、Clu、Tff3 和 Opn 蛋白的相对表达。（*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001）。3.2. RNA-seq 显示与免疫炎症反应和肾小管上皮细胞凋亡相关的肾损伤为探究 MC 诱导肾损伤的潜在机制，对 MC 组的肾组织进行了 RNA-seq。生成火山图以鉴定与对照组相比，MC 组p 值小于 0.05 且绝对 log2 倍变化（log2FC）大于 1 的差异表达基因（DEG）（ 图 2A）。创建热图以可视化 MC 组中上调和下调最显着的前 20 个基因（ 图 2B）。进行 GO 和 KEGG 富集分析，以阐明 与 DEGs 相关的生物学过程和途径。结果表明，DEGs 在与细胞增殖和分化、能量代谢、炎症反应和免疫反应调节相关的途径中显着富集（ 图 S1A 和 S1B）。此外，Hallmark 通路富集分析表明，DEGs 主要富集于免疫调控、 细胞周期调控、细胞死亡、炎症反应、分化和细胞组织发育（ 图 2C）。 反应组通路富集分析表明，DEGs 在调控细胞增殖、分化和细胞死亡、免疫应答、DNA 损伤应答和内分泌激素合成方面显著富集 [ 图 2D]。 此外，还进行了 GSEA 以鉴定 DEGs 中显著富集的基因集。结果显示细胞灭亡、IL2_STAT5_SIGNALING 和 TGF_BETA_SIGNALING 途径上调（ 图 2E），可能导致肾损伤的细胞炎症和细胞凋亡。BILE_ACID_METABOLISM 和 PEROXISOME 通路的下调（ 图 2F）可能与细胞代谢紊乱和内分泌紊乱有关。图 2.MC 组与对照组（NC）对 RNA-seq 数据进行差异分析和通路富集。（A）火山图显示 MC 组相对于 NC 组的差异基因。显着性测量在 Y 轴上描述 （-log10（P.Value）），在 X 轴上描述效应大小 （logFC）。蓝色点代表下调基因 （logFC≤-1），红色突出显示的点代表上调基因 （logFC≥1）。（B）热图显示了 MC 组中最显着上调和下调的前 20 个基因。（C）基于标志基因集的差异基因通路富集分析。显着富集的途径在 Y 轴上描绘，-log10（p 值）在 X 轴上描绘。颜色代表 p 值的显着性，图表的大小代表富集基因的数量。（D）差异基因的反应组富集分析。图表的颜色表示 p 值，图表的大小表示富集基因的数量。（E、F）基于标志性途径的 GSEA 富集分析。MC 组有 3 条通路显著上调，2 条通路下调。3.3 MC 暴露后大鼠肾脏的免疫微环境分析鉴于许多免疫炎症相关途径显着富集，我们使用 CIBERSORTx 算法探索了 21 个免疫细胞亚群的对照组和 MC 组之间的免疫浸润。 图 3A 说明了每个样品中免疫细胞的相对比例。总体而言，巨噬细胞在 MC 组中更为普遍，而 B 细胞和嗜酸性粒细胞在对照组中更为常见。21 种免疫细胞之间相关性的热图如图 3B 所示。根据图 3 C，M0 巨噬细胞、浆细胞、Th2 细胞和 Treg 细胞被认为是促炎的，在 MC 组中明显更丰富。此外，进行了 mMCP 计数器来说明对照和 MC 样品之间的免疫浸润（ 图 3D）。此外，我们发现一些经典的免疫相关基因如 Psmb8 和 Psmb9 在 MC 组中显著上调，这进一步证明了炎症应激在 MC 介导的肾损伤中起着不可忽视的作用（ 图 3E）。图 3.免疫微环境分析。（A）MC 和对照样品中 21 种免疫细胞百分比的直观图片。（B）相关热图说明了免疫细胞浸润之间的关系。（C）MC 组和对照组 21 个免疫细胞的比例。（D）两组 10 个免疫细胞的表达。（E）两组 Psmb8 和 Psmb9 的相对表达量。（*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ns，不显著）。3.4. MC 诱导肾损伤潜在靶点的鉴定从 ChEMBL 和 STITCH 数据库中共收集了 320 个 MC 靶点，从 GeneCards 数据库中获得了 518 个肾损伤靶点。维恩图用于识别 MC 诱导肾损伤的 20 个潜在靶点（ 图 4A）。生成热图以可视化这 20 个靶标在样品中的表达（ 图 4B）。结果发现，MC 组 Pcsk9、Ace、Mmp9、Tnf、Itga4、Casp3、Rad51、Ctsd、Havcrl、Lcn2 和 Tgfb1 上调，而 Akrlal、Mtr、Vdr、任、Mme、Aqp1、Cat、Slc5al 和 Dpp4 下调。 图 S1C 显示了 20 个目标之间的相关性。KEGG 和 Reactome 富集分析显示，20 个靶点主要富集于内分泌激素代谢，特别是肾素-血管紧张素系统的代谢、 胰岛素分泌和能量代谢，以及免疫应答和细胞死亡的调节（ 图 4C 和 4D).这些发现表明，MC 可能通过内分泌紊乱和细胞因子风暴诱导大鼠肾损伤。由于免疫相关通路的显着富集，生成了相关热图以显示 20 个靶点和 21 个免疫细胞之间的关系（ 图 4E）。观察到，MC 组高表达基因与幼稚 B 细胞 、浆细胞、M0 巨噬细胞、Treg 细胞、Th1 细胞和 Th2 细胞呈显著正相关（ 图 1）。 4B 和 4E）。创建网络图以可视化 MA 和 CA 与这 20 个目标之间的关系，揭示了它们之间的强烈相互作用（ 图 4F）。图 4.识别 MC 诱导的肾损伤的潜在靶点。（A）MC 诱导的肾损伤潜在靶点的 Veen 图。（B）热图显示两组中 20 个潜在靶标的表达。（C）潜在靶点的 KEGG 富集分析。（D）潜在靶点的反应组富集分析。显着富集的途径在 Y 轴上描绘，富集因子在 X 轴上描绘。颜色代表 p 值的显着性，图表的大小代表富集基因的数量。（E）CIBERSORTx 与 20 个潜在靶点之间的相关热图。（F）MC 与 20 个潜在目标之间的相互作用网络。3.5. ML 算法和中心目标获取为了进一步了解 MC 诱导的肾损伤的生物学过程，我们使用 LASSO 回归、RF 和 MCODE 算法来识别在 MC 肾毒性网络中起关键作用的枢纽基因（ 图 5A-C）。 图 5A 说明了 20 个目标基因的 LASSO 回归分析。 图 5B 给出了 RF 分析的结果，节点大小阈值为 0.3 来选择特征基因。MCODE 用于鉴定高度互联的基因，在图 5C 中以黄色突出显示。通过交集 3 种 ML 算法鉴定的基因，选择了与 MC 诱导的肾损伤相关的两个关键基因： 任和 Casp3（ 图 5D）。接下来，我们分析了这两个基因的功能及其与免疫细胞的相关性。 任主要富集在参与能量代谢和炎症反应的途径中，而 Casp3 主要富集在与细胞生长、增殖、存活以及免疫防御和炎症调节相关的途径中（ 图 5E 和 5F）。此外， 任与嗜酸性粒细胞、 内皮细胞 、肥大细胞、巨噬细胞和活化 T 细胞呈显著正相关，而 Casp3 与活化 B 细胞、 调节性 T 细胞 、成纤维细胞、淋巴管和 M0 巨噬细胞呈显著正相关（ 图。 5G-H 和 S1D）。图 5.机器学习算法和中心目标获取。（A）采用 LASSO 模型鉴定重要基因。偏似然偏差绘制为 log（λ） 的函数。垂直线表示模型选择的 1-SE 规则。选择 5 个在最佳λ处系数为非零的基因。（B）使用 RF 算法选择 7 个特征基因。图形的横坐标是重要性分数，纵坐标是基因名称。（C）使用 Cytoscape 中的 CytoHubba 插件识别 14 个特征基因，应用度拓扑分析方法。（D）MC 诱导的肾损伤枢纽基因的维恩图。（E）基于标志基因集的任单基因 GSEA 富集分析。（F）基于标志基因集的 Casp3 单基因 GSEA 富集分析。（G）任与 10 个浸润免疫细胞之间的相关性。（H）Casp3 与 10 个浸润免疫细胞之间的相关性。3.6. 任和 Casp3 通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）参与 MC 诱导的肾损伤和细胞凋亡根据之前的研究， 任基因通过将血管紧张素原转化为血管紧张素 I，编码肾素，肾素是一种参与肾脏血压调节和体液平衡 的关键酶。Casp3 基因编码 caspase-3，这是一种细胞凋亡的必需执行酶（Dudoignon 等人，2019 年，Eskandari 和 Eaves，2022 年）。为明确任和 Casp3 是否通过 RAAS 参与 MC 诱导的肾损伤和细胞死亡，我们测试了相关指标。WB 分析显示， MC 组任和 ACE2 显著下调，而 ACE1 上调 （ 图 6A 和 6B）。 任表达降低可能与进行性肾损伤导致肾素耗竭有关。WB 分析还显示，MC 组中 Caspase-3、cleaved-Caspase-3、Bax 和 Bad 显着上调（ 图 6C 和 6D）。大鼠肾脏组织的 IF 染色显示，Caspase-3 的活化形式 cleaved-Caspase-3 在 MC 组中广泛过表达，与 WB 结果一致（ 图 6E）。此外，大鼠肾切片的 TUNEL 染色显示，在 MC 暴露后，位于肾小管中的凋亡细胞数量显着增加（ 图 6F）。 因此，Caspase-3 通过促进肾小管上皮细胞凋亡，在 MC 介导的肾损伤中发挥重要作用。图 6.MC 暴露通过 RAAS 和细胞死亡介导肾损伤。（A）ACE1，ACE2 和任蛋白的蛋白质印迹。以 GAPDH 为参比蛋白。（B）条形图显示了 MC 组和对照组之间 ACE1、ACE2 和任蛋白的相对表达。（C）Caspase3，Cleaved-Caspase3，Bax 和 Bad 蛋白的蛋白质印迹。以 GAPDH 为参比蛋白。（D）条形图显示了 MC 组和对照组之间 Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax 和 Bad 蛋白的相对表达。（E）大鼠肾脏的免疫荧光显示 Cleaved-Caspase3 上调（比例尺= 100μm）。（F） MC 组和对照组之间的 TUNEL 测定。对照组肾切片的 TUNEL 测定的代表性图像显示很少的 TUNEL 阳性细胞。MC 组的肾切片显示 TUNEL 阳性细胞增加（比例尺= 100μm）。3.7. 任和 Casp3 的分子对接为了预测针对 MC 介导的肾损伤的潜在药物靶点，我们分别对任和 Casp3 与 MA 和 CA 进行了分子对接模拟。获得 4 组药物-靶点相互作用：CA-任、MA-任、CA-Casp3 和 MA-Casp3。 如图 7A 所示 ，任的氨基酸残基 G217、A218、S219、Q13、Y155、Y14、Y15、F117、V30、F31、T216 和 A303 主要与 CA 结合并相互作用。同样，任的 A303、T216、G217、A218、S219、T12、Q13、V30、Y14、Y155、G302 和 Y15 是与 MA 相互作用的活性位点（ 图 7B）。对于 Casp3，Casp3 的氨基酸残基 K154、P155、K271、Y37、S112、K38、S36、G153 和 T152 主要与 CA 结合并相互作用，而 MA 主要作用于 Casp3 的 K271、G153、S113、S112、P155、K154、D34、S36、K38、M39、Y41 和 R11、T152 的活性位点（ 图 7C 和 7D).这些发现表明，MC 可以与上述靶蛋白结合并导致肾损伤。然而，需要进一步的实验验证来确认这些相互作用及其生物学意义。图 7.MC 与枢纽基因的分子对接模式和相互作用。（A） CA-任，（B） MA-任，（C） CA-Casp3 和 （D） MA-Casp3。
总结
综上所述，本研究采用 NT 结合 RNA 测序和体外实验验证，阐明了 MC 诱导肾损伤的潜在分子机制，并确定了两个潜在靶点。这些发现不仅扩展了我们对 MC 毒理学的理解，也为肾损伤的药物开发和治疗提供了新的策略和方向 。具体来说，靶任和 Casp3 的药物的开发可以通过调节这些分子的活性来减弱或逆转 MC 诱导的肾损伤。然而，需要额外的体内实验验证来确保这些结果的可靠性和稳健性。此外，由于生物系统的复杂性，应该承认 NT 和分子对接模型在充分模拟复杂生物相互作用方面的局限性。计算模型通常简化了生物系统的复杂性，忽略了许多生物因素（如缺乏动态模拟、体内环境的影响、溶剂效应、构象灵活性等），因此无法完全反映体内环境的真实情况。在未来的研究中，结合体外实验、体内模型以及更复杂的计算模拟（例如分子动力学模拟）将有助于克服这些限制，并提供更精确的预测和更生物学相关的结果。尽管存在这些局限性，这项工作为理解 MC 诱导的肾损伤的潜在机制提供了全面的证据。 值得注意的是，考虑到 MC 在食品工业中的广泛应用，评估 MC 在食品中的安全性对于保护食品安全和公众健康至关重要。相关监管机构在制定食品安全标准时，应考虑 MC 的长期暴露风险和剂量效应。我们计划在未来与相关监管机构合作，共同推进对 MC 安全性的全面评估。
