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Invest Ophthalmol Vis Sci期刊上，影响因子为 5。
为了进一步了解结膜在干燥眼病（SS DED）中的具体作用，作者采用了 MRL/lpr 小鼠，这是一种与临床实践相符的性别差异的 SS 模型。 25 首先，作者测量了 MRL/lpr 小鼠与 DED 相关的症状和炎症水平。与对照 MRL/Mpj 相比，MRL/lpr 小鼠表现出明显减少的泪液分泌（ Fig. 1 A），以及阳性 lissamine 染色区域的增加（ Fig. 1 B）。慢性角膜炎症被认为是 DED 的一个重要背景，作者的 qRT-PCR 结果显示 S100a9、Il6 和 Ccl5（ Figs. 1 C–E）这些与 DED 相关的炎症因子显著上调。 28 泪液炎症反应也是 SS DED 的一个特征，观察到明显的 CD4+T 细胞浸润（ Figs. 1 F, 1 G）。综上所述，MRL/lpr 小鼠表现出 SS DED 表型。
SS 模型 MRL/lpr 和对照 MRL/Mpj 的结膜 scRNA-seq 分析。(A) 通过酚红线测量泪液分泌。(B) 虹膜绿染色角膜。(C–E) qRT-PCR 显示角膜中 S100a9、Il6 和 Ccl5 的转录水平。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 (F, G) 腺体中 CD3 和 CD4 的 IF 染色。标尺=50 µm。(H) 实验设计示意图。(I) 结膜四个 scRNA-seq 数据集的整合 UMAP 图。(J) Featureplot 展示每个簇的经典标记。(K) 四个数据集中每个簇的比例。IF，免疫荧光。
作为一种高分辨率和可靠性的技术，scRNA-seq 之前已被应用于眼表疾病的研究，包括翼状胬肉和干眼症。11 29 作者应用 scRNA-seq 和 scTCR-seq 来研究干燥综合征相关干眼症（SS DED）的结膜变化（ Fig. 1 H），经过质量控制后，从 MRL/Mpj 组获得了 19,701 个细胞，从 MRL/lpr 组获得了 16,511 个细胞。同一组的样本具有令人满意的关联性（ Supplementary Fig. S1 A）。根据经典标记定义了簇，包括上皮细胞（Krt15, Epcam）、成纤维细胞（Lum）、内皮细胞（Pecam1）、髓系细胞（Lyz2）、T 细胞（Cd3e）、黑色素细胞（Dct, Plp1）和施万细胞（Mpz； Figs. 1 I, 1 J）。首先，作者发现上皮细胞/成纤维细胞的比例减少（ Fig. 1 K），因此作者决定进一步研究上皮细胞的变化。
为了了解上皮的变化，作者提取上皮细胞进行亚聚类。基底上皮（Trp63）、角质形成细胞（Muc1、Aqp5）、纤维样上皮（Vim）和杯状细胞（Muc5ac）被定义为先前研究（ Figs. 2 A、 2 B），作者发现角质形成细胞比例明显减少（ Fig. 2 C）。为了证明这一点，作者进行了 KRT19（整个结膜上皮）、MUC1（角质形成细胞）和 P63（基底上皮）的多重免疫组化（mIHC）染色，发现 SS 结膜中 MUC1/KRT19 的比率显著降低（ Figs. 2 D、 2 E）。Western blot 结果也显示 SS 结膜中角质形成细胞标志物 MUC1 下调（ Figs. 2 J、 2 K）。Bannier-Helaouet 等人报道的基于类器官的最新研究已经认识到结膜角质形成细胞的水分泌功能， 14 为结膜参与泪液分泌提供了新的视角。同样，作者的 GO 分析显示角质形成细胞的富集通路包括“细胞分泌的正向调控”、“胞吐作用”和“囊泡组织”（ Fig. 2 F），这与 Bannier-Helaouet 等人的研究结果相似。 因此，作者假设干燥综合征（SS）中存在功能性结膜角质细胞的丢失，这与泪液的量和质量有关。
结膜上皮在其组成上显示出明显的改变。(A) 结膜上皮的 UMAP 图。(B) Vlnplot 显示了每个簇的标记。(C) 两组结膜上皮中每个簇的比例。(D) 两组结膜中 KRT19、MUC1 和 P63 的 mIHC 染色。标尺=10 µm。(E) 两组中 MUC1 与 KRT19 面积比的比较。*P < 0.05, **P < 0.01。(F) 角质细胞的富集 GO 通路。(G) 结膜基底上皮的 UMAP 图。(H) Dotplot 显示了每个亚簇的标记。(I) 两组结膜基底上皮中每个亚簇的比例。(J–-M) 两组结膜中 PLAUR、MUC1 和 LGR4 的 Western blot。(N) MHC-II+基底上皮的富集 GO 通路。(O) 流式细胞术显示 Epcam+MHC-II+细胞比例。(P) 两组结膜中 P63 和 MHC-II 的 IF 染色。标尺=50 µm。(Q) 两组结膜中 P63+MHC-II+细胞比例的比较。IF，免疫荧光。
基底上皮细胞具有强大的增殖和分化能力，而终末分化的角质形成细胞丢失可能与基底上皮细胞功能障碍有关。30 因此，作者对基底上皮细胞进行了亚聚类分析，并根据有丝分裂期和先前标记（ Figs. 2 G, 2 H, Supplementary Fig. S1 B）识别出 10 个亚群。考虑到每个亚群的比例，作者发现主要变化是 Lgr4+基底的显著增加和 Plaur+基底的减少（ Fig. 2 I）。Western blot 也表明 LGR4 的上调以及 PLAUR 的下调（ Figs. 2 J, 2 L, 2 M）。因此，作者思考这两个亚群的功能及其与其他亚群的相互作用。
关于史蒂文-约翰逊综合征，一种严重的自身免疫性疾病，之前的文章也发现了一组具有抗原呈递能力的角质形成细胞。31 在作者的数据集中，作者也发现了一个有趣的簇，即 SS 结膜中的 MHC-II+基底细胞（参见 Fig. 2 I）。这个簇中的几乎所有细胞都高度表达 MHC-II 分子，包括 H2-Eb1、H2-Aa、H2-Ab1、H2-DMa、H2-DMb2、H2-DMb1 和 Trp63，同时 GO 分析显示最富集的通路集中在抗原处理和呈递（ Fig. 2 N）。这个簇也无法表达免疫细胞的标志物，包括 Lyz2、C1qc、Gzma、Cd3e 或 Cd79a（ Supplementary Fig. S1 C）。为了验证这一点，通过流式细胞术，作者发现 SS 结膜中 Epcam+ MHC-II+细胞的比例显著增加（ Fig. 2 O），作者还观察到 SS 结膜中 P63 和 MHC-II 免疫染色的共定位（ Figs. 2 P, 2 Q）。为了进一步在 SS 模型中确立这一点，作者重新分析了 MRL/lpr 小鼠泪腺的数据集。 25 作者根据文章中给出的标志物进行了聚类分析，得到了相似的结果（ Supplementary Figs. S2 A, S2 B），并且基底上皮细胞出现了明显的丢失（ Supplementary Fig. S2 C）。 然后，作者提取了基底上皮细胞进行亚聚类分析，几乎所有基底上皮细胞都转变为 MHC-II+基底细胞（图 11D，图 12E），这表明这是干燥综合征（SS）中的一种常见现象。因此，这可能意味着在自身免疫性疾病中存在与抗原呈递相关的特定上皮存在是一种共同特征。
Wnt/β-Catenin 通路激活使基底上皮细胞改变其命运
在作者观察到从 Plaur+基底上皮向 Lgr4+基底上皮的转变后，作者进一步研究了它们的功能影响。通路“上皮细胞分化”的 GSEA 显示 Plaur+基底上皮显著上调，而 Lgr4+基底上皮下调（ Fig. 3 A）。包括“上皮细胞增殖”、“上皮细胞分化”、“上皮发育”和“上皮细胞增殖调控”在内的 GO 通路得分在 Lgr4+基底上皮中均较低（ Fig. 3 B）。Lgr4+基底上皮的 KEGG 分析也表明细胞外基质和 Wnt 上调（ Fig. 3 C），这两者都与上皮间质转化和纤维化相关。以上所有结果都表明 Lgr4+基底上皮无法发挥正常上皮的强大功能，似乎正在向间质方向转变。
SS 相关干眼症中 Wnt/β-catenin 在结膜基底上皮中的激活。(A) Plaur+基底上皮和 Lgr4+基底上皮中 GO 通路“上皮分化”的 GSEA 分析。(B) Plaur+基底上皮和 Lgr4+基底上皮之间“上皮细胞增殖”、“上皮细胞分化”、“上皮发育”和“上皮细胞增殖调控”通路评分的比较。(C) Lgr4+基底上皮代表性富集的 KEGG 通路。(D) 假时间相关基因表达的 Heatmap。(E) Monocle3 进行的每个基底亚群共表达模块。(F) Lgr4+基底上皮特定模块中富集的 GO 通路。(G) Plaur+基底上皮特定模块中富集的 GO 通路。(H–K) WNT5A、β-catenin 和 LEF1 的 Western blot 结果及两组比较。ns = 无显著差异，****P < 0.0001。(L) 两组结膜中 LGR4、β-catenin 和 WNT5A 的 mIHC 染色。标尺=50 µm。
为了了解结膜上皮细胞的轨迹，作者使用 monocle3 进行了伪时间分析。Plaur+基底上皮细胞被设置为轨迹的起点，因为它在相关上皮增殖和分化通路中得分最高（ Supplementary Fig. S3 A），轨迹和前 10 个基因展示如下（ Supplementary Figs. S3 B, S3 C）。表达 Muc1 和 Aqp5 的角质形成细胞被认为是终末细胞（ Fig. 3 D）。通过共表达模块分析，作者提取了 Lgr4+基底上皮细胞和 Plaur+基底上皮细胞的特定模块（ Fig. 3 E）。Plaur+基底上皮细胞的特定模块的 GO 分析显示通路与上皮增殖相关（ Fig. 3 G），而 Lgr4+基底上皮细胞的富集通路再次集中在 Wnt 信号通路（ Fig. 3 F）。因此，作者认为 Wnt 信号通路是影响 Lgr4+基底上皮细胞的重要因素，因为它与上皮间质转化和纤维化密切相关。此外，Western blot 结果显示 WNT5A 和 LEF1 显著上调，但β-catenin 没有上调（ Figs. 3 H, 3 I, 3 K）。 关于β-catenin 转移至细胞核以发挥其调节作用的机制，以及 Western blot 未能定位到特定细胞中的变化， 18 作者进行了 mIHC 以了解β-catenin 的位置。在 SS 模型中，β-catenin 在 Lgr4+基底上皮细胞核中显示出更强的信号（ Fig. 3 L）。综上所述，作者证明了 SS 富集的 Lgr4+基底上皮中 Wnt/β-catenin 信号通路的上调。
细胞间通讯暗示 TGF-β是 Lgr4+基底上皮的介质
在之前的部分中，作者关注了上皮组织，并推断出基底上皮中存在 Wnt/β-catenin 信号通路的激活——增殖和分化能力差——功能角蛋白细胞丢失——DED。然后，作者思考哪些细胞调节基底上皮的变化及其具体介质。通过应用 Cellchat，作者发现 SS 结膜中的相互作用数量普遍增加（图 A，图 B）。估计了 Wnt/β-catenin 通路的力量，与对照组相比，Wnt/β-catenin 信号通路普遍上调，尤其是在 Lgr4+基底上皮中（图 C）。接下来，作者回顾了 Lgr4+基底上皮与其他簇之间的分子对，捕获了 Tgfb1-(Tgfbr1-Tgfbr2；图 D）。TGF-β是一种已知的分泌介质，具有广泛的生物学功能，包括促纤维化、免疫调节和上皮间质转化，并且也是 Wnt/β-catenin 信号通路的可靠上游调节因子。为了验证其作用并缩小其来源，作者进行了 nichenet 分析，以识别作为配体的最强分子。 对于 Lgr4+基底上皮细胞，TGF-β具有最高的配体活性，其表达几乎完全局限于髓系细胞和 T 细胞（ Fig. 4 E）。因此，作者认为 TGF-β是 Lgr4+基底上皮细胞上最有希望的介质，而髓系细胞和 T 细胞可能是其主要来源。
每个簇的细胞间通讯。(A) Cellchat 中的相互作用数量。(B) Cellchat 中每对簇之间的相互作用强度。(C) MRL/Mpj 和 MRL/lpr 小鼠的结膜 Wnt 信号通路网络。(D) Lgr4+基底细胞作为受体与其他簇和分子对的相互作用。(E) 在 nichenet 中将 Lgr4+基底上皮细胞作为受体时，每个因子的配体活性。(F) 两组巨噬细胞中 Tgfb1 表达的 Featureplot。(G) 两组结膜的 F4/80 和 TGF-β1 的 IF 染色。标尺=50 µm。IF，免疫荧光。
为了进一步定位 TGF-β的来源，作者发现 SS 结膜中的 TGF-β1+髓系细胞增加（ Fig. 4 F）。通过免疫荧光共定位，作者验证了 TGF-β1+F4/80+巨噬细胞仅在 SS 结膜中存在（ Fig. 4 G）。然而，作者在结膜中未能发现 TGF-β1+CD3+T 细胞（ Supplementary Fig. S4 A）。因此，作者得出结论，巨噬细胞来源的 TGF-β是 Lgr4+基底上皮活性的关键介质。
在巨噬细胞被视为致病性 TGF-β的主要来源后，作者希望进一步阐明在全身自身免疫性疾病背景下，免疫细胞向结膜局部浸润的促进因素。首先，作者关注了内皮细胞。既往翼状胬肉结膜的 scRNA-seq 数据提供了内皮细胞的详细视图，并定义了一群 VWF+PLVAP+的活化内皮细胞。 29 在作者的 scRNA-seq 数据中，作者获得了血管内皮细胞、淋巴内皮细胞以及与内皮-间质转化（EnMT）相关的内皮细胞（ Figs. 5 A、 5 B）。活化血管内皮细胞的比例也有所增强（ Fig. 5 C），这表明了免疫细胞浸润的可能机制。全身自身免疫性疾病通常伴随免疫细胞的迁移，而局部侵袭也依赖于与内皮细胞的相互作用。 32 为了理解这一点，作者采用了 cellphoneDB 来展示内皮细胞与髓系细胞之间存在配体和受体的配对。 骨髓细胞来源的 VEGFA 在干燥综合征相关结膜中特异性地与 NRP1、KDR 和 FLT1 相互作用（图 5D），这些都与血管生成和血管通透性增强有关。 30 因此，作者推测巨噬细胞为免疫细胞浸润提供了条件。
巨噬细胞与内皮细胞的相互作用。(A) 两组内皮细胞亚群的 UMAP 图。(B) 每个内皮细胞亚群的标记点的点图。(C) 两组中每个内皮细胞亚群的占比。(D) 由 cellphoneDB 检测到的髓系细胞与成纤维细胞之间的分子对。(E) 髓系细胞 11 个 seurat 簇的 UMAP 图。(F) 显示每个 seurat 簇关键标记点的 Vlnplot。(G) 减去后的巨噬细胞 seurat 簇的 UMAP 图。(H) 显示关键标记点表达分布的特征图。(I) 每个 seurat 簇中“M1”、“M2”、“急性炎症反应”和“慢性炎症反应”的通路评分。(J) GSVA 显示“炎症反应”、“TGF beta 信号通路”和“上皮间质转化”的富集评分。(K) 两组巨噬细胞差异表达基因(DEG)的火山图。(L) 巨噬细胞上调 DEG 的富集 GO 通路。DEG，差异表达基因。
因此，作者对髓系细胞进行了亚聚类分析，获得了 11 个亚群（图 Fig. 5 E）。第七个亚群被定义为中性粒细胞（S100a9 高表达）。第二和第五个亚群被认为是单核细胞（Lyz2+C1qc–；图 Fig. 5 F）。随后，作者提取了巨噬细胞并重新聚类，分为七个亚群。第二、第三和第六个亚群 Vegfa 表达相对较高，且在干燥综合征结膜中的种群数量增加（图 Figs. 5 G，图 5 H）。这些亚群具有“血管发育调控”、“血管发育正向调控”和“血管内皮生长因子分泌”的高评分（图 Fig. 5 I）。总体而言，巨噬细胞中的促血管生成效应被上调。
考虑到巨噬细胞对免疫反应的影响，作者还计算了 M1 和 M2 表型的得分以及免疫相关通路。Vegfa+簇二得分最高的是“M1”、“急性炎症反应”和“慢性炎症反应”，GSVA 也表明簇二中 TGF-β信号通路最为活跃（ Figs. 5 I, 5 J），这些共同表明簇二可能在 SS 结膜的血管生成和纤维化中发挥主要作用。总体来看，SS 结膜中的巨噬细胞上调了 Ccl8、H2-D1 等与抗原呈递相关的分子（ Fig. 5 K），免疫相关通路的激活也在 GO 通路中富集（ Fig. 5 L）。免疫激活和促纤维化作用共存是 SS 结膜中髓系细胞的主要特征。
成纤维细胞显示出在干燥综合征结膜中招募和激活 T 细胞的能力
成纤维细胞通过 Lum 表达进行定义，并根据每个亚群中最表达的标记基因进行亚群分类。识别出六个成纤维细胞亚群，包括 Ccl19 高、Ccl11 高、Cxcl14 高、Ccn5 高、Cd44 高和 Col1a11 高成纤维细胞，以及一个肌成纤维细胞群（图 A，图 B）。一个显著的变化是 Ccl19 高、Ccl11 高和 Cxcl14 高成纤维细胞比例的增加（图 C）。先前研究表明，成纤维细胞具有促炎作用，包括在结膜疾病或干燥综合征中上调 ECM、补体体和 Ccl19、Cxcl12 及 Cxcl13 等细胞因子。通路评分分析显示这些亚群具有最高的急性炎症反应评分，并且在这些亚群中发现了 Cxcl12 和 Ccl19 的上调，以及补体体亚群三（见图 E）。因此，认为这类成纤维细胞作为炎症促进因子参与其中。
肌成纤维细胞和 Cd44 高表达成纤维细胞之间标记表达的邻近性和同源性表明它们之间关系密切。在排除这两个高度独立的簇后，作者根据 CytoTRACE 分析将 Col11a1 高表达成纤维细胞识别为最原始的细胞（见 Supplementary Fig. S5 F），而成纤维细胞转变为炎症表型。此外，成纤维细胞与 T 细胞之间的 Cxcl12-Cxcr4 配对被认为对增强 T 细胞浸润至关重要。 34 通过 cellphoneDB，作者发现对照组和 SS 组中均存在 Cxcl12-Cxcr4 和 Cxcl14-Cxcr4 的通讯（见 Supplementary Fig. S5 G），这可能作为结膜中 T 细胞募集的促进因素。
T 细胞激活迄今为止被认为是干燥综合征发病机制中的重要因素。35 在作者的数据集中，作者观察到干燥综合征结膜中存在独特的 T 细胞组成（ Fig. 6 A），其中显示出相对保守的γδT 组（Trdc 和 Il17a）以及新出现的 CD4+T 组和 CD8+T 组（ Figs. 6 B, 6 C）。在 CD8+T 细胞中，Gzmk 和 Ifng 表达量很高，作者将其注释为 CD8+CTL 以执行杀伤作用。在 CD4+T 细胞中，作者发现 Ctla4 表达量相对较高，暗示其身份为 CD4+Treg。通过通路评分，可以推测 CD8+CTL 主要参与急性炎症反应，而γδT 有助于维持慢性炎症（ Fig. 6 D）。有趣的是，几乎所有 IL-17A 和 IFN-γ转录都集中在 T 细胞上（见 Supplementary Fig. S6 A），这表明 T 细胞在干燥综合征发病机制中的不可或缺作用。适应性免疫和淋巴细胞相关免疫在结膜中明显上调（见 Supplementary Fig. S6 B），针对 T 细胞的干预可能取得满意效果。
T 细胞在 SS 结膜中表现出特异性激活。(A)两组中 T 细胞亚群的 UMAP 图。(B)特征图显示了关键标志物的表达。(C)两组中每种 T 细胞亚群的占比。(D)每种 T 细胞亚群中“急性炎症反应”和“慢性炎症反应”的通路评分。(E)两组中 TCR 独特克隆型的数量。(F)两组中占据的库空间克隆指数。(G)MRL/lpr 小鼠及其对照组泪腺中 T 细胞亚群的 UMAP 图。(H)MRL/lpr 小鼠及其对照组泪腺中 T 细胞亚群的占比。(I)MRL/lpr 小鼠及其对照组泪腺中每种 T 细胞亚群中“急性炎症反应”、“慢性炎症反应”和“T 细胞趋化性”的通路评分。
TCR 反映了 T 细胞 VDJ 区的显著变异和扩增，36 ，作者发现独特克隆型数量（ Fig. 6 E）的显著增强和克隆指数的明显延长（ Fig. 6 F），这两者都证明了 T 细胞的显著激活。为了进一步确立激活的 T 细胞浸润是局部组织中的常见现象，作者还重新分析了 MRL/lpr SS 模型泪腺的 scRNA-seq 数据。有趣的是，作者发现了相似的结果，即 CD4+Treg 和 CD8+CTL 群体有明显扩大（ Figs. 6 G, 6 H）。然后，作者想知道这些新浸润的簇是否代表炎症反应，作者发现 CD8+CTL 具有“急性炎症反应”和“T 细胞趋化性”的几乎最高评分（ Fig. 6 I），这证明激活的促炎 T 细胞浸润可能是 SS 局部组织中的共同特征。总的来说，作者推测成纤维细胞启动了 T 细胞浸润，并观察到 SS 结膜中存在激活的 T 细胞。
总结
在结膜中，除了炎症反应外，作者发现分泌水的角质形成细胞比例减少，从而揭示了在非 SS 干眼症中尚未报道的功能性上皮细胞丢失。总体而言，作者认识到角质形成细胞丢失是 SS 结膜与干眼症相关的关键功能因素，并发现巨噬细胞来源的 TGF-β促进了基底上皮的 Wnt/β-catenin 信号激活，导致分化不良。巨噬细胞与血管内皮相互作用，并促进免疫细胞浸润，而免疫成纤维细胞群体的扩大在激活的 CD8+CTL 募集中发挥作用。作者扩展了对结膜在 SS 干眼症中作用的认识，并阐述了免疫实质相互作用。未来的研究可能集中于干扰致病巨噬细胞的影响，以阻碍关键的促血管生成和促纤维化作用。。
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