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导语 
作者在 12 周龄时在雄性小鼠的股骨上产生骨折，然后在骨折前第 0 天以及骨折后第 5 天和第 15 天收集并处理组织进行空间转录组学。作者使用 10× Visium CytAssist 平台，并在每个时间点对两只小鼠进行采样。使用一系列 R 包进行数据分析，包括 Seurat，Monocle，CARD 和 CellChat 包，如作者的实验方案流程图所示（图。 1A ）。作者在先前的研究结果基础上采用了一种优化的脱钙方法，使用莫尔斯溶液改进了确定 RNA 范围 20 的方法。在这里，作者发现莫尔斯方法导致的 DV200 分数高于标准 EDTA 脱钙，表明 RNA 保存性更好（图）。 1B 这种 RNA 质量的提高转化为每个点的测序质量明显优于文献中报告的水平。这些股骨样本共有 24,213 个斑点，平均每个斑点有 16254 个 UMI 和 4131 个基因（图）。 1C
图1.小鼠股骨骨折愈合的空间转录组学工作流程和质量控制结果概述。
使用CytAssist 平台进行福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织切片的空间转录组学工作流程的示意图。该过程包括用于初始组织成像的 H&E 染色，然后是探针连接、透化、条形码和文库构建，并通过 Seurat、CARD 和 Monocle 软件包进行数据分析。B 条形图显示了使用莫尔斯溶液和 EDTA 脱钙方法处理的样品之间的 RNA 质量比较，如 DV200 百分比（RNA 完整性的衡量标准）所示。数据以标准差 （SD） ±均值表示。C Violin 图显示断裂前第 0 天以及断裂后第 5 天和第 15 天每个空间点检测到的基因数量 （nFeature_Spatial） 和唯一分子标识符 （nCount_Spatial） 的数量。D 骨折前第 0 天以及骨折后第 5 天和第 15 天小鼠股骨的组织学和空间转录组学分析。上图：H&E 染色图像。中间面板：空间图显示断裂后第 5 天每个空间点检测到的基因数量 （nFeature_Spatial） 和唯一分子标识符 （nCount_Spatial） 的数量。下图：空间图显示断裂前第 0 天以及断裂后第 5 天和第 15 天每个空间点的唯一分子标识符（UMI，nCount_Spatial）数量。骨折线用虚线标记，股骨近端标记，gp 生长板，Ca 愈伤组织。
这些数据揭示了骨折愈合过程中不同的细胞活动。在第 0 天，基因表达主要集中在骨髓内，反映了未骨折骨中造血细胞和基质细胞的高代谢活性。随着愈合过程的开始，基因表达在第 5 天转向骨膜区域，其中检测到的基因多样性的增加表明活跃的生物修复过程。相反，骨折部位附近的骨髓区域表现出基因表达降低，这可能是由于早期组织损伤和坏死造成的。到第 15 天，基因表达主要定位于骨折愈伤组织，从在正在经历新骨形成的区域检测到的基因数量增加中，活跃的骨化很明显（图 199999 年）。1D ）。 1 这些数据提供了详细且高质量的骨折愈合图谱，强调了作者的方法改进使空间转录组数据质量有了显着提高。
使用空间转录组学分析，作者的研究揭示了骨折愈合环境中复杂的细胞簇网络。使用 Harmony 进行数据集成，在三个时间点（第 0 天、第 5 天和第 15 天）总共包含 24,213 个点，能够识别出通过均匀流形近似和投影 （UMAP） 和空间图预测的 27 个独特的空间集群（图 1999 年）。 2A ）。将这些簇分为三个主要组的层次树图进一步证实了这种分类，表明愈合骨内具有不同的细胞功能（图， 2B ）。 2A 每个簇的前 10 个标记基因如附表 2 所示。为了对这些簇进行精细分类，作者利用了 GPTCelltype 包 28，这是一种先进的工具，用于根据空间转录组学的基因表达数据预测细胞类型。采用这种方法来分析显示的顶级表达基因，每个簇的代表性标记基因与热图一起列出。与骨骼和肌肉组织相关的簇（簇 0、9、24、12、2、16、21、26、6、1 和 4），以蓝色标记，包括骨细胞（Sost，Bmp8a）和各种肌肉相关组 （Myh2，Myh4），主要映射到皮质骨和周围的肌肉组织 （图， 2C 左图）。 与造血和炎症反应相关的红色标记簇（簇 23、3、11、15、20、5 和 17），如中性粒细胞 （S100a8， Ngp）、血小板（Gp1ba， Gp5）和红细胞（Car1， Gypa），集中在骨髓和骨折部位，反映了骨折后立即活跃的关键免疫反应和伤口愈合过程。除了丰富细胞景观外，脂肪细胞（Plin1、Cfd）位于肌肉和骨膜之间，在能量储存和局部炎症调节中发挥作用。滑膜细胞（Prg4、Htra4）存在于关节附近，有助于关节润滑（图， 2C 中图）。绿色标记簇（簇 8、25、19、22、14、18、7、10 和 13），包括间充质祖细胞（Postn、Aspn）、软骨细胞（Col2a1、Acan）、巨噬细胞（Mmp12、Arg1）和破骨细胞（Ctsk、Mmp9），参与组织再生，并在第 5 天和第 15 天变得更加突出，表明它们在形成愈伤组织周围的愈合和再生阶段的作用（图 15）。 2C ，右侧面板）。
通过 Harmony 集成的数据的 UMAP 可视化，显示 27 个不同的空间簇，每个簇的颜色不同，以代表骨折愈合组织内的各种细胞群。B 层次热图图显示已识别空间簇的基因表达谱。集群通过 GPTCelltype 包进行命名。C 在小鼠股骨骨折模型中描绘骨愈合第 0 天、第 5 天和第 15 天主要空间簇分布的空间图。
作者在三个时间点（骨折后第 0、5 和 15 天）进行的空间转录组学分析显示，参与骨折愈合的各种细胞簇的分布和频率发生了重大变化。使用 UMAP 可视化和相对频率数据， 2C 作者观察到细胞群的动态变化，这些变化与不断发展的愈合环境相对应。最初，在第 0 天，细胞景观主要以皮质和肌肉相关细胞为特征。骨折后，某些肌肉细胞类型的比例发生了明显的变化，包括快肌骨骼肌细胞比例的降低（簇 6、1、4），以及慢肌骨骼肌细胞（簇 12）、成肌细胞和骨骼肌祖细胞（簇 2）和氧化骨骼肌细胞（簇 26）的比例增加。这表明一种适应性反应，其中更具弹性或支持修复过程的肌肉细胞类型变得更加普遍。此外，骨折后纤维源祖细胞（簇 16）的比例增加。这些细胞对于产生细胞外基质和支持血管生成的能力至关重要，这对于支持肌肉修复和骨折愈合至关重要 29,30。氧化骨骼肌细胞和纤维生成祖细胞比例的增加表明向积极参与修复和再生过程的细胞类型转变。 3 该分析还详细介绍了免疫相关簇、脂肪细胞和滑膜细胞的行为，这些簇、脂肪细胞和滑膜细胞在作者的空间转录组数据中共同标记为红色。与肌肉和再生相关细胞不同，这些簇在不同时间点的相对比例没有显着变化，但红细胞（簇 5、17）除外，红细胞在骨折后表现出显着的比例下降。这种减少可能是由于损伤引起的坏死后纤维化增加造成的。 4 损伤后与再生相关的簇的比例显着增加，第 8 簇和第 25 簇（间充质祖细胞）的第 5 天以及第 7、10 和 13 簇（成骨细胞）的第 15 天尤为明显。这些增加意味着随着愈合过程的进行，再生活动增强，软骨细胞（第 14 簇）和间充质祖细胞（第 8 簇和第 25 簇）等细胞数量增加，以促进新的软愈伤组织形成和初始稳定性。 5 对这些细胞动力学的进一步探索将增加作者对驱动组织再生和骨修复的基本机制的理解。
骨折愈合中骨膜区空间动力学：MPCs 向 rMPCs 的分化
接下来，作者对骨膜区域内的细胞动力学进行了详细分析，骨膜区域是骨再生的关键区域。使用 Loupe Cell 软件，作者从骨膜区域手动选择细胞斑点，随后根据 GPTCelltype 命名法分析这些细胞（图– 3A C）。在第 0 天，骨膜细胞斑主要由间充质祖细胞（第 18 簇）和成骨细胞和破骨细胞的混合物（第 7 簇和第 10 簇）组成，反映了受伤前骨骼的基线状态。到第 5 天，骨膜区域内的细胞组成发生了显着变化，现在由多种软骨细胞（第 14 簇）和骨膜衍生细胞主导，作者在这项研究中将其称为再生间充质祖细胞（rMPC，第 8 簇）。这种变化表明祖细胞在再生过程中的出现。值得注意的是，到第 5 天，骨膜区域内巨噬细胞（第 19 簇）的比例显着增加，这与它们在愈合早期阶段介导炎症和组织重塑的作用一致。到第 15 天，成骨细胞 （OB） 和破骨细胞 （OC） 占骨膜区域细胞群的大部分，表明骨修复的晚期阶段，重塑占主导地位（图）。 3D
A 骨折后第 0 天、第 5 天和第 15 天骨折部位的组织学切片，染色以显示愈合骨内细胞的分布和形态。这些图像说明了骨折部位细胞组成和结构随时间的变化，并通过识别各种细胞类型的空间注释突出显示。B UMAP 图显示了细胞类型在不同愈合阶段的基因表达谱的聚类情况。每个簇都经过颜色编码以代表不同的细胞类型，包括间充质祖细胞 （MPC）、再生 MPC （rMPC）、巨噬细胞 （MF）、软骨细胞 （CH） 和破骨细胞/成骨细胞 （OC/OB）。C 面板显示骨膜内特定细胞类型在愈合时间线内的分布。每种细胞类型的颜色编码与 UMAP 图一致，说明骨膜内的空间组织如何从第 0 天到第 15 天演变。D 条形图显示了第 0 天、第 5 天和第 15 天每个细胞簇的相对比例，反映了愈合过程中骨膜细胞群的动态变化。E 小提琴图描绘了在骨膜中鉴定的不同细胞类型中与骨膜细胞功能和骨愈合相关的关键基因的表达模式。F UMAP 图显示第 0 天、第 5 天和第 15 天骨膜细胞的细胞周期状态。每个图都采用颜色编码以指示细胞周期的不同阶段（G1、S 和 G2/M）。G 条形图说明了不同骨膜细胞类型在第 0 天、第 5 天和第 15 天的增殖率，基于细胞周期分析，表明细胞活性的变化对愈合过程至关重要。
作者进一步探索了骨膜干细胞的标记基因，使用小提琴图显示基因表达在不同斑点区域的分布（图。 3E ）。这些图强调了 Thy1、Ctsk 和 Pi16 等已建立的标记物在 MPC 人群中高度表达，强调了它们的茎样特性和在骨愈合中的关键作用。此外，作者利用空间表达图来说明文献中报道的骨膜祖细胞的几个关键标志物的定位和表达，并发现 Pdgfra、Ctsk、Ly6a、Pi16 和 Edil3 的表达模式与骨修复所必需的骨膜区域密切相关，为骨膜干细胞在愈合过程中的功能动力学提供了新的见解。
作者之前的研究建立了骨折 scRNA-seq 数据库，并记录了愈伤组织区域骨折后早期增殖祖细胞 （PPC） 的出现，这对于骨折愈合和干细胞分化至关重要 3。在这项研究中，作者观察到 rMPC 亚群特异性表达 PPC 群体的标志物，如 Acta2、Lrrc15 和 Tagln（图）， 3E 表明肌成纤维细胞特征表明其强大的再生能力。细胞周期分析（图 3F, G ）进一步证实了 rMPC（簇 8）的活跃增殖能力，这在第 5 天尤为明显，多种骨膜细胞类型显示出增强的增殖活性。这种增殖表明骨膜对骨愈合的贡献具有动态和关键性，强调该区域不仅充当结构边界，而且还充当再生的积极参与者。
鉴于 Bmp2 在骨折愈合开始中的关键作用，作者使用单细胞 RNA 测序数据对其表达进行了深入分析。Bmp2 主要在再生相关簇中表达，包括间充质祖细胞（MPC，第 18 簇）、软骨细胞（CH，第 14 簇）和成骨细胞（OB，第 10 簇）。在时间上，Bmp2 在基线（第 0 天）表达水平较低，并在骨折后第 5 天显着上调，在第 15 天保持升高水平。这种显着的上调表明 Bmp2 积极参与早期和中期再生过程，特别是在 rMPC 和成骨细胞中，强调了其在骨折愈合关键阶段的关键调节作用。
由于 Visium 平台的分辨率约为 60 μm，每个点可能包含 2 到 10 个单细胞，因此需要初始反卷积分析来识别每个点内不同细胞类型的比例。利用作者之前发表的骨折愈合单细胞转录组学图谱，作者对不同时间点的骨膜区域斑点进行了详细的反卷积（图）。 4
图4.跨骨折愈合阶段的骨膜区域的反卷积分析和通路富集分析。
A 骨折后第 0 天、第 5 天和第 15 天的连续组织学切片显示骨膜区域。在每张组织学图像下方，显示了使用 CARD 包的空间图和相应的反卷积结果，说明了每个空间点内推断的细胞组成。B 热图显示了第 0、5 和 15 天在骨膜中识别的不同细胞簇的 GSVA 结果。每行代表一个 KEGG 或 Hallmark 通路。C SCENIC 分析结果显示了不同骨膜细胞类型和时间点的转录调节因子活性。该分析揭示了可能指导细胞响应断裂的分化和功能的调节环境。
在第 0 天，使用 CARD 反卷积方法进一步分析通过空间转录组命名法确定为间充质祖细胞 （MPC） 的骨膜区域内的斑点。结果表明，这些斑点主要由 scRNA-seq 鉴定的骨祖细胞 （OsteoPs） 和 MPC 组成，分别对应于形成层和纤维层。因此，MPC 斑点在空间上与骨膜的两层相关，这两层对于骨折修复都至关重要31（图）。 4A
第 5 天的分析突出显示了代表再生 MPC （rMPC） 的红框区域内的斑点，其中单细胞映射主要揭示了 PPC 和肌肉细胞。这些发现表明，rMPC 斑点表现出肌成纤维细胞特征，可能有助于通过肌肉收缩实现机械稳定性。标志着 rMPCs 和软骨之间界面的蓝框区域主要由软骨细胞和肥大软骨细胞组成，靠近皮质骨区域的肥大软骨细胞比例更大，这与相应的 H&E 染色结果一致（图。4A ）。
到第 15 天，重点是软骨和成骨细胞界面处的红框区域，反卷积表明软骨细胞和成骨细胞的组成主要由软骨细胞和成骨细胞组成，界面处存在肥厚软骨细胞，与 H&E 染色结果一致。蓝框区域突出了编织骨区域，该区域主要由成骨细胞、M2 型巨噬细胞和破骨细胞组成，说明了骨愈合后期复杂的细胞动力学。该分析强调了反卷积在解析骨膜区域内的细胞结构和阐明它们在骨修复不同阶段的作用方面的效用（图。4A ）。
GSVA（基因集变异分析）用于评估不同空间区域内不同细胞类型和时间阶段的标志性和 KEGG 通路的富集情况。分析显示，MPC 和再生 MPC （rMPC） 细胞中与组织损伤和修复相关的通路显着富集，例如缺氧、TGF-β、血管生成和 Wnt 信号通路，突显了它们在骨愈合早期阶段的参与。值得注意的是，与 DNA 复制和细胞周期相关的途径在第 5 天在 rMPC 中显着激活，表明它们处于活跃的增殖状态。
此外，果糖、甘露糖和半乳糖等代谢途径在软骨细胞中发生了最明显的改变，这表明这些代谢途径在软骨愈伤组织的形成中起着至关重要的作用。与损伤后炎症相关的通路在巨噬细胞中富集，而破骨细胞/成骨细胞 （OC/OB） 细胞表现出与 MPC 相似的变化，并且在第 15 天尤为明显，表明正在进行的骨重塑和修复过程（图 1999999 年）。4B ）。
接下来，进行了单细胞调控网络推理和聚类（SCENIC）分析32，以揭示对不同区域观察到的时空变异至关重要的基因调控网络。rMPCs 的关键转录调节因子包括 Meox2、En1 和 Foxp1，表明它们在修复过程中调节 rMPC 功能中发挥重要作用。对于软骨细胞，已经鉴定出 Sox5、Sox8 和 Sox9 等转录因子，强化了它们在软骨发生中的作用。对于 OC，主要的转录调节因子是 Prdm1、Spi1 和 Vdr，突出了破骨细胞分化和活性所必需的调节动力学。该分析不仅绘制了骨愈合过程中的动态细胞反应，还突出了促进这一过程的复杂分子相互作用（图）。 4C
GSEA 进一步揭示了 MPC 和再生 MPC 之间响应骨折的明显功能转变。MPC 通常参与维持骨完整性，呈现出与骨化和成骨细胞分化相关的基因集的富集。相比之下，在修复过程中激活的 rMPC 表现出与机械应激反应、炎症和细胞外基质组织相关的基因集的富集，这对于有效的组织再生至关重要。点图分析进一步证实了与生物力学刺激（Ccn1、Piezo1、Yap1 和 Taz）和血管生成（Hif1a、Emcn、Notch4 和 Tie1）相关的基因的骨折后上调，强调了骨膜对愈合的适应性反应
空间伪时间分析至关重要，因为它突出了骨愈合过程中细胞活动的动态进展，将空间和时间基因表达数据联系起来，以跟踪细胞类型从损伤反应到组织再生的进化。接下来，作者利用 Monocle 对空间分辨的点进行伪时间测序，根据每个点的基因表达谱分配时间进展。然后将该伪时间映射到空间位置，揭示了 MPC 的早期伪时间位置以及软骨细胞和成骨细胞的后期位置，表明它们各自在骨愈合的早期和晚期阶段的作用（图。 5A ）。
A 骨折后第 0 天、第 5 天和第 15 天的组织学切片，每个切片都覆盖有从蓝色到红色的伪时间颜色渐变。该梯度表示基于基因表达谱的骨膜内从早期到晚期细胞状态的推断假时间。B 轨迹图追踪骨膜细胞的发育途径，突出了从间充质祖细胞 （MPC） 到成骨（簇 10、13）和软骨（簇 14）谱系的转变。颜色渐变表示伪时间的进展，描绘了这些细胞的进化轨迹。C 轨迹图显示按类型分类的细胞簇，颜色代表不同的细胞身份，说明不同细胞群在愈合过程中如何通过伪时间进化。D 热图显示了不同阶段和细胞类型（从 MPC 到分化成骨和软骨成骨细胞）的关键转录因子的表达模式。这些热图将转录变化与伪时间对齐，以揭示驱动细胞分化的调控环境。
生成降维图以可视化结果，颜色代表伪时间（图。5B ）和不同时间点的细胞类型（图）。 5C 在第 0 天，MPC 分化为成骨谱系，而在第 5 天和第 15 天，它们分化为再生 MPC （rMPC），然后进展为软骨形成和成骨命运。分支表达分析模型（BEAM）分析进一步揭示了这些分化途径沿的转录因子活性。在第 0 天，转录因子 Prdm1 和 Spi1 的早期上调表明静止骨膜 MPC 开始向成骨相关细胞分化过程，为随后的骨形成和愈合奠定基础。在第 5 天和第 15 天，Sox9、Nr4a1 和 Hif1a 等因子在软骨成膜途径中上调，而 Dlx5、Sp7 和 Hey1 在成骨途径中上调（图）。 5D
还检查了标记物的时间表达模式。rMPC 标志物（包括 Acta2、Lrrc15 和 Tagln）的表达在第 5 天和第 15 天的分化假时间呈先升高后下降的趋势，反映了它们在骨折修复早期阶段的动态作用。相反，软骨形成和成骨标志物（例如Acan 和 Alpl）的表达随着时间的推移不断增加，与组织再生的进展一致，如第 5 天和第 15 天观察到的那样。这种多方面的方法提供了对驱动不同愈合阶段骨再生的细胞动力学和分子机制的深入见解。
空间转录组数据对于破译细胞串扰特别强大。作者使用 CellChat 软件 27 分析了骨折愈伤组织的空间转录组数据，其中输出和输入信号相互作用强度相互比较，作为串扰强度的量度。为了清楚地可视化空间相互作用，根据其相似性合并某些细胞簇：簇 1、4、6、12、21 和 26 组合为骨骼肌细胞;簇 5 和 17 合并为红细胞;聚类 8 和 25 合并为 rMPC;簇 19 和 22 组合为巨噬细胞（图）。 2B 随着骨折愈合的进展，作者观察到 rMPCs 和巨噬细胞区域内的细胞通讯活动水平很高（图）， 6A 突出了对这些区域内愈合过程至关重要的活跃细胞间对话。scRNA-seq 数据进一步证实了这一分析，该数据显示，随着愈合进展，MPC、PPC、组织修复相关巨噬细胞 （MF2）、OC 和 OB 之间的相互作用持续增加（图 1）。 6B
图 6.空间细胞通讯分析揭示了 MPC 驱动的巨噬细胞募集的信号通路和空间动力学。
A 点图显示了第 0、5 和 15 天细胞类型之间相互作用强度的空间转录组学 （ST） 分析。每个气泡的大小对应于相互作用强度。B 点图显示断裂后第 0、5 和 10 天细胞类型之间相互作用强度的单细胞 （SC） 分析。MPC 间充质祖细胞、PPC 增殖祖细胞、CH 软骨细胞、HCH 肥厚软骨细胞、EOB 早期成骨细胞、OB 成骨细胞、Syn 滑膜细胞、EC 内皮细胞、MF1 炎性巨噬细胞、MF2 组织驻留巨噬细胞、OC 破骨细胞。C 第 5 天突出显示不同细胞类型共定位的空间图。在第 5 天，MPC 与巨噬细胞共定位。插图提供了选定区域的放大视图，说明了这些细胞在骨折部位的详细空间排列。D CARD 包计算的组织驻留巨噬细胞评分沿骨折部位增厚的骨膜分布，显示巨噬细胞数量随着距骨折距离的增加（0-4 mm）而减少。R2 = 0.2962 表示趋势的强度。E 第 5 天骨折 Gli1ER/Td 小鼠股骨中巨噬细胞分布的免疫荧光图像。左图：H&E 染色。F 骨折部位附近和远处骨膜区域每平方毫米巨噬细胞密度的比较。n = 3/组。数据表示为 SD±均值，并通过未配对双尾 t 检验进行分析。G 气泡图描述了不同细胞类型（MPC、OB、OC、MF2）在断裂后不同天数（D0、D5、D10）之间相互作用的显着性和概率。 每行代表一条信号通路，每列显示特定的细胞类型相互作用，颜色强度表示通讯概率，轮廓气泡标记具有统计学意义的相互作用。红色信号是 MPC 区的通路，蓝色的信号是 OB 区的通路。
鉴于 Visium 技术的分辨率有限，该技术通常在单个点内包含多种细胞类型，作者再次采用了 CARD26 反卷积框架来增强作者的分析。作者整合了单细胞 RNA 测序数据，以准确确定每个空间点内不同细胞类型的比例，特别关注 rMPC 和巨噬细胞区域。断裂后第 5 天，rMPC 区表现出明显的空间排列。详细放大显示，在远离断裂线的部位，在已识别的 MPC 点内，巨噬细胞（紫色）的比例低于 MPCs（黑色）。然而，在靠近骨折线的地方，MPC 斑点内巨噬细胞的比例显着增加，这表明正在积极愈合的区域的细胞相互作用增强（图）。 6C, D 为了进一步验证这些发现，作者进行了体内实验。作者和其他人已经报道，Gli1creERT2 有效地标记骨膜祖细胞 6,21,33。这些细胞在骨折愈合的早期阶段显着增殖，随后分化为软骨细胞和成骨细胞，积极参与修复过程。该模型与作者通过单细胞和空间转录组学记录的骨膜祖细胞的变化密切相关。因此，Gli1creERT2 基因工程小鼠可以作为追踪骨膜祖细胞的体内模型。作者给 3 个月大的雄性 Gli1ER / Td 小鼠连续 5 天给予他莫昔芬，然后进行股骨骨折。 骨折后五天，作者观察到 Gli1+ 细胞扩增以及骨膜增厚。值得注意的是，在靠近骨折线的骨膜中，F4/80 染色的巨噬细胞数量明显多于远离骨折线的区域（图）。 6E, F 有趣的是，这些巨噬细胞中的大多数位于 Gli1+ 骨膜祖细胞附近。
为了进一步研究细胞通讯如何影响这些空间变化，作者采用了 CellChat 方法，使用单细胞 RNA 测序数据进行更高分辨率的分析。气泡图描绘了特定的通路变化;在 MPC 区域内，Postn、Mif、Mdk 和 Cxcl12 信号传导显着增加，强调了 MPC 和 MF2 巨噬细胞之间的这些相互作用在骨折愈合的不同阶段发挥的潜在作用（图 1 6G ）。同时，OB、OC 和 MF2 巨噬细胞中 RANKL 介导的信号传导增加，而 Spp1 信号传导显着增加，这两者都主要与 OB 区域相关（图）。 6G 总的来说，这些发现为协调支撑骨再生过程的复杂细胞相互作用所必需的信号通信提供了重要的见解。
总结
总之，作者的研究促进了对骨愈合背后的空间和时间动态的理解。本研究中产生的空间转录组学数据为未来研究组织再生和骨修复机制提供了宝贵的资源。
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