1131-未分化或去分化黑色素瘤很棘手 ，它们失去了常规黑色素瘤标记物的染色。使用突变特异性免疫组织化学（IHC）BRAF V600E并结合临床病史（如腋下）是诊断的关键。
1132-未分化黑色素瘤：一项临床病理与基因表达分析研究——HMGA2作为诊断标志物的检测
摘要
未分化黑色素瘤因其定义性特征（缺乏S100蛋白、Sox10、Mart1和HMB45等黑色素细胞标志物表达）构成独特的诊断挑战。尽管存在这种异常表型，该肿瘤仍具有BRAF和NRAS突变等已知黑色素瘤驱动变异。由于其形态学特征多变且缺乏黑色素细胞分化，常需通过分子检测鉴定黑色素瘤相关驱动变异以支持诊断。本研究纳入27例未分化黑色素瘤，通过基因表达谱分析将其与经典型黑色素瘤进行比较（包括同患者匹配病例与非匹配病例）。未分化黑色素瘤的组织学谱系多样，可包含上皮样、梭形、多形性、横纹肌样及气球样细胞成分，常伴坏死。值得注意的是，部分病例显示显著的间质成分（如黏液样和血管结构）。研究发现组织学分类是决定经典型与未分化型黑色素瘤基因表达差异的主要因素。此外，未分化黑色素瘤存在多条显著上调的基因表达通路（包括上皮-间质转化相关通路），这些数据为其异常表型提供了潜在解释。特别重要的是，HMGA2被确定为未分化黑色素瘤中上调最显著的基因，免疫组化证实其可作为敏感且特异的诊断标志物，用于鉴别形态学重叠且缺乏黑色素细胞分化的模仿者。
引言
自Agaimy等2016年的开创性描述以来，未分化黑色素瘤已成为公认的诊断难题。其定义为丧失所有常规黑色素瘤表型与免疫组化特征的黑色素瘤，典型形态为异型上皮样或梭形细胞群，部分病例呈现多形性皮肤肉瘤或未分化多形性肉瘤样特征。亦有报道显示可伴横纹肌肉瘤样转化、血管肉瘤样转化、异源性骨形成及上皮分化等。除形态谱系多样外，该肿瘤必然缺失S100蛋白、Sox10、Mart1和HMB45表达。
尽管存在这些异常表型，未分化黑色素瘤仍携带BRAF、NRAS和NF1等常规黑色素瘤驱动基因变异。但与经典型不同，研究提示NRAS变异（而非BRAF）可能是其主要驱动因素。目前学界普遍认为，诊断需通过分子检测证实黑色素瘤兼容性变异。虽然BRAF V600E或RAS Q61R等突变特异性免疫组化有辅助价值，但其应用受限因仅部分病例携带这些特定MAPK通路突变。
在此背景下，寻找辅助诊断的生物标志物尤为重要。我们既往通过二代测序发现未分化黑色素瘤中非Q61R NRAS突变与RAC1突变富集。本研究进一步对匹配与非匹配病例进行基因表达谱比较，揭示HMGA2免疫组化可作为区分形态学模仿者的有效诊断标志物，并通过特定通路改变阐明了其分子发病机制。
材料与方法
病例选择
本研究经机构审查委员会批准。共纳入27例未分化黑色素瘤病例，包括12例用于分子谱分析的病例及24例可用于免疫组化研究的病例（其中9例同时进行分子谱分析和HMGA2免疫组化评估）。12例未分化黑色素瘤来自Fischer等既往研究，其余病例选自2008-2024年间常规诊疗及C.D.M. Fletcher与J.L. Hornick医生的会诊档案。
病例筛选标准如下：
所有肿瘤均不表达黑色素细胞标志物S100、Sox10、Mart1和HMB45；
无支持其他诊断的特异性免疫组化或形态学特征。 辅助诊断依据包括：
通过DNA测序检测到已知黑色素瘤驱动突变（12/27，44%来自既往研究，3/27，11%来自临床检测）。临床检测病例中，1例通过二代测序发现NRAS Q61L和RAC1突变，1例在转移灶中检出NRAS Q61T突变，1例通过Foundation One液体活检发现BRAF V600E突变及高肿瘤突变负荷；
免疫组化检测到BRAF V600E（4/27，15%）或NRAS Q61R突变（2/27，8%）；
未检出特定驱动突变者（6/27，22%）需有黑色素瘤病史且未分化肿瘤为后续转移灶。
对照组包括：
6例经典型黑色素瘤（来自6例后续发生未分化黑色素瘤患者的匹配病例）；
6例基于黑色素瘤相关标志物表达、肿瘤类型（原发/转移）及组织可用性筛选的经典型黑色素瘤。
另从档案中回顾性选择56例未分化黑色素瘤形态学模仿者用于免疫组化研究，包括：非典型纤维黄色瘤（AFX，11例）、多形性皮肤肉瘤（PDS，11例）、未分化多形性肉瘤（UPS，11例）、肉瘤样鳞癌（11例）及低分化鳞癌（12例）。
基因表达谱分析
RNA提取与数据获取
从24例黑色素瘤样本（12例经典型，12例未分化型）中提取总RNA。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织RNA提取在布莱根妇女医院先进分子谱分析中心完成，使用High Pure FFPET RNA分离试剂盒（Roche）。基因表达谱分析采用nCounter MAX/FLEX系统（MD安德森癌症中心）及PanCancer通路分析面板（770基因，NanoString）。样本浓度经Qubit荧光定量检测，完整性经Agilent TapeStation评估。合格样本取100 ng RNA与荧光标记探针杂交，经nCounter Prep Station纯化后，用nCounter Digital Analyzer扫描。
数据分析
原始数据导入ROSA-LIND云平台（Rosalind Inc.）。剔除”管家基因标度因子超限”的样本后，最终分析10例经典型和9例未分化型（含3对匹配病例）。使用iDEP2.01软件进行后续分析：基于DESeq2包对原始计数进行尺寸因子标准化并获取正则化对数转换值；主成分分析基于转换值完成；对200个变异最高基因进行Pearson距离层次聚类；差异表达分析以|log2倍数变化>1|且FDR Q<0.1为阈值；通路分析采用MSigDB Hallmarks集合和GAGE方法（FDR Q<0.2）。
免疫组化
S100、Sox10、Melan A、HMB45、BRAF V600E和RAS Q61R检测方法见补充表S1。HMGA2检测采用4 μm FFPE切片，柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）高压修复，Cell Signaling Technology抗体（1:800）及EnVision Plus检测系统（Dako）。对24例未分化型、10例经典型及所有非黑色素细胞肿瘤进行HMGA2核染色评估，按范围（0；1+，1%-10%；2+，11%-50%；3+，>50%）和强度（弱/中/强）半定量评分。计算敏感性和特异性时仅纳入染色范围≥2+的病例。
结果
黑色素瘤队列的临床病理特征
研究纳入27例未分化黑色素瘤病例（男19例，女8例），年龄26-91岁（中位64岁）。包括2例原发灶（7%）、3例复发灶（11%）和22例转移灶（82%）。原发灶均为溃疡性未分类型，浸润深度12-19mm，无原位成分。形态学显示：上皮样（26%）、梭形（11%）、上皮样+梭形（15%）、上皮样+多形性（30%）等多种亚型。19%病例伴黏液样或血管性间质改变，70%存在坏死，核分裂数1-26/mm²（中位8）。所有病例S100、Sox10、Mart1和HMB45均阴性。
对照组12例经典型黑色素瘤（男9例，女3例）年龄29-89岁（中位73岁），其中6例为后续发生未分化黑色素瘤患者的匹配病例。5例原发灶位于头颈（2例）、躯干（2例）和下肢（1例），1例为肩背部皮下转移灶。原发灶深度1.1-12mm，80%伴溃疡，组织学分为浅表扩散型（2例）、未分类型（2例）和结节型（1例）。除1例外均表达黑色素细胞标志物。
非黑色素瘤肿瘤的临床病理特征
56例形态学模仿者包括：
非典型纤维黄色瘤（AFX，11例）：头颈部原发（91%），中位年龄79岁，男:女=10:1
多形性皮肤肉瘤（PDS，11例）：头颈部（91%），中位年龄79岁，男:女=10:1
未分化多形性肉瘤（UPS，11例）：下肢（36%）和内脏（36%），中位年龄66岁，男:女=3:8
肉瘤样鳞癌（11例）：头颈部（82%），中位年龄72岁，男:女=9:2，91%表达p63/p40/CK5/6
低分化鳞癌（12例）：头颈部（58%），中位年龄78.5岁，男:女=5:1，均表达p63/p40/CK5/6
匹配病例的基因表达谱分析
对3对匹配病例的654个非管家基因分析显示：
主成分分析（PCA）显示未分化型与经典型沿PC1显著分离（P=0.025），表明组织学分类是转录组差异的主要来源（图3A）
鉴定出67个差异表达基因（DEGs），HMGA2上调最显著（log2FC=6.14，FDR<0.0001）
通路富集分析显示未分化型中上皮-间质转化（EMT）、E2F有丝分裂靶标等通路激活（图3E）
整体队列的基因表达验证
扩展分析19例样本（9未分化型+10经典型）证实：
PCA仍显示沿PC1的组织学分型聚类（P<0.0001）（图4A）
鉴定165个DEGs，HMGA2仍显著上调（log2FC=2.01，FDR<0.1）
EMT通路持续富集，同时发现NFκB、JAK-STAT3等通路激活（图4C）
HMGA2表达特征
未分化黑色素瘤：79%（19/24）阳性，其中58%为强阳性（2-3+范围）
经典型黑色素瘤：60%（6/10）阴性，仅20%强阳性
非黑色素瘤肿瘤：39%（22/56）阳性，但仅36%阳性病例达到2-3+范围
非典型纤维黄色瘤
3/11例（27%）显示HMGA2表达：
1例2+范围强阳性
1例1+范围强阳性
1例1+范围弱阳性
多形性皮肤肉瘤
6/11例（55%）存在HMGA2表达：
1例2+范围强阳性
2例1+范围中度阳性
3例1+范围弱阳性
未分化多形性肉瘤
仅1/11例（9%）呈阳性：2+范围强阳性
低分化鳞状细胞癌
6/12例（50%）表达HMGA2：
2例3+范围（分别呈中度和强阳性）
2例2+范围中度阳性
2例1+范围（分别呈中度和弱阳性）
肉瘤样鳞状细胞癌
6/11例（55%）阳性：
1例3+范围强阳性
5例1+范围（2例中度阳性，3例弱阳性）
HMGA2诊断未分化黑色素瘤的敏感性与特异性
设定HMGA2阳性阈值≥2+范围时：
总体参数： 敏感性75% | 特异性85% | 阳性预测值(PPV)0.69 | 阴性预测值(NPV)0.88
仅非上皮性模仿者（AFX/PDS/UPS）： 特异性提升至91% | 敏感性保持75% | PPV 0.86 | NPV 0.83
图1 未分化黑色素瘤的形态学谱系
A. 背部原发黑色素瘤显示溃疡形成及深部浸润，肿瘤由上皮样细胞组成（核分裂象22个/mm²）
B. 转移性未分化黑色素瘤呈现上皮样与横纹肌样细胞形态
C. 转移性未分化黑色素瘤显示相对温和的梭形细胞形态伴束状生长区域
D. 部分病例可见气球样细胞改变
E. 某些病例存在间质改变，如图中转移性黑色素瘤由上皮样转移性黑色素
瘤由上皮样和多形性细胞组成，伴黏附性丧失和黏液样间质
F. 此转移性未分化黑色素瘤以梭形细胞为主，伴显著黏液样间质改变和玻璃样变血管
图2 经典型与未分化型黑色素瘤的对比
A-B（患者6）：
A. 腿部原发结节型经典型黑色素瘤，由上皮样与痣样细胞组成
B. 后续发生的未分化型移行转移灶，含上皮样及显著多形性细胞
C-D（患者3）：
C. 颊部原发浅表扩散型黑色素瘤，由相对单一的小-中等上皮样细胞（核仁显著）组成
D. 股骨转移性未分化黑色素瘤，含小上皮样细胞混合多形性/多核细胞
E-F（患者2）：
E. 头皮原发经典型黑色素瘤，由相对温和的梭形细胞组成
F. 复发性未分化黑色素瘤，特征为上皮样/多形性细胞伴非典型核分裂
图3 匹配病例的基因表达分析
（基于NanoString PanCancer Pathways panel对3对匹配病例的分析）
A. 主成分分析（PCA）图显示654个非管家基因的rlog转换表达数据聚类
形状对应患者编号，颜色对应组织学类型
PC1与未分化/经典型状态显著相关（P=0.025） B. 前200个变异基因的层次聚类树状图（Pearson相关/完全连锁） C. 火山图显示67个差异表达基因（DEGs）
红点：未分化型上调基因（log2FC>1且FDR<0.1）
蓝点：下调基因（log2FC<-1且FDR<0.1） D. GAGE分析鉴定的Hallmark通路富集表（FDR<0.2） E. 上皮-间质转化相关通路瀑布图（FDR<0.2），x轴显示单个基因
图4 整体队列的基因表达分析
（9例未分化型 vs 10例经典型）
A. PCA图显示PC1与组织学类型显著相关（P<0.0001）
形状对应原发/复发/转移状态 B. 前200个变异基因层次聚类树状图 C. Hallmark通路富集表（GAGE分析，FDR<0.2） D. HMGA2表达结果（匹配分析左图 vs 整体分析右图）
在所有分析中HMGA2均显著上调
图5 HMGA2免疫组化表达总结
（缩写：AFX=非典型纤维黄色瘤，CM=经典型黑色素瘤，PDS=多形性皮肤肉瘤，pdSCC=低分化鳞癌，sSCC=肉瘤样鳞癌，UM=未分化黑色素瘤，UPS=未分化多形性肉瘤）
图6 黑色素瘤中HMGA2表达
A-B. 腿部原发未分化黑色素瘤：
A. 上皮样细胞伴黏液样间质（×100）
B. 强阳性（3+范围）
C-D. 背部原发未分化黑色素瘤：
C. 非典型上皮样细胞
D. HMGA2中度阳性（3+范围）
E-F. 原发与转移病例对比：
E. 原发经典型阴性
F. HMGA2转移未分化型中度阳性（3+范围）
图7 模仿者的HMGA2表达
（多数模仿者阴性或弱阳性，部分示例如下）
A-B. 非典型纤维黄色瘤：
A. 以梭形细胞为主
B. HMGA2强阳性（2+范围）
C-D. 多形性皮肤肉瘤：
C. 非典型梭形细胞浸润皮下
D. HMGA2强阳性（2+范围）
E-F. 未分化多形性肉瘤：
E. 多形性上皮样细胞伴活跃核分裂
F. HMGA2强阳性（2+范围）
G-H. 低分化鳞癌：
G. 浸润性上皮样/多形性肿瘤细胞
H.HMGA2 强阳性（3+范围）
讨论
近年来，我们对未分化黑色素瘤分子发病机制的认识取得了重大进展。现已明确，未分化黑色素瘤携带与经典型黑色素瘤相同的分子驱动因素（即MAPK通路改变和NF1突变）。值得注意的是，我们前期研究发现未分化黑色素瘤可能富集非经典MAPK通路突变（如非Q61R NRAS变异）和RAC1激活突变。甲基化谱研究也显示未分化黑色素瘤与经典型聚类紧密。然而，这些肿瘤为何呈现显著未分化表型仍缺乏合理解释。为探究这一问题并寻找新诊断工具，我们对匹配和非匹配的经典型与未分化型黑色素瘤进行了基因表达谱分析。
本研究有三项重要发现，它们深化了我们对未分化黑色素瘤生物学的理解，并提示HMGA2免疫组化可作为新型诊断标志物：
第一，匹配病例分析表明肿瘤表型本身（即经典型或未分化型）是决定两组转录组差异的主要因素。这一差异在扩展至非匹配病例的分析中仍然存在。
第二，基因表达谱揭示了显著的信号通路差异：未分化型中上皮-间质转化（EMT）通路显著富集（FDR Q<0.2）。这与未分化型的形态特征（如表达结蛋白等间叶标志的横纹肌肉瘤样转化）相吻合。我们前期发现的RAC1突变也被证实可诱导黑色素细胞间质表型转换。这些证据共同表明间质表型转换是未分化黑色素瘤发展的关键步骤。有趣的是，本研究发现部分病例存在黏液样或血管性间质成分，这可能是间质表型转换的形态学体现，对转移灶诊断尤为重要。此外，未分化型还富集NFκB介导的TNFα信号、IL6-JAK-STAT3信号和干扰素γ反应通路，这些均与肿瘤发生发展密切相关。Kasago等报道未分化/去分化黑色素瘤对免疫检查点抑制剂反应良好，可能与这些通路改变的肿瘤微环境相关，值得深入研究。
第三，在所有分析中，HMGA2是未分化型相较经典型上调最显著的基因。HMGA2作为胚胎发育期表达、成熟组织受限的转录因子，其异常表达与多种恶性肿瘤（包括黑色素瘤进展）相关。虽然基因表达谱未包含原发未分化型病例，但两组数据中HMGA2过表达的重复性提示其在发病中的重要作用。重要的是，HMGA2免疫组化在未分化型中阳性率（79%）显著高于形态学模仿者（39%），诊断敏感性75%、特异性85%。尤其在与非上皮性肿瘤（AFX/PDS/UPS）鉴别时，特异性可达91%。但需注意，仅当≥2+范围（11%-50%以上）的阳性才具诊断意义。匹配病例比较显示，未分化型HMGA2表达呈升高趋势，与转录组数据一致。尽管BRAF V600E和RAS Q61R突变特异性免疫组化有辅助价值，但由于未分化型中非BRAF V600E/非NRAS Q61R驱动突变普遍存在，HMGA2的中等敏感性和高特异性使其成为重要的辅助诊断工具。
本研究存在以下局限：测序成功病例数较少，但匹配与非匹配队列结果的重复性支持结论可靠性；随访信息有限，需进一步研究基因表达特征与预后的关联；严格筛选标准（要求全部4种黑色素细胞标志物缺失）可能遗漏部分去分化黑色素瘤病例；原发未分化型病例较少，需明确HMGA2在其表达特征。
总结，本研究首次揭示了未分化黑色素瘤区别于经典型的转录组特征，证实表型分类的重要性，并发现潜在治疗靶点通路。更重要的是，我们鉴定出HMGA2作为未分化型特异性过表达基因，其免疫组化检测在鉴别诊断中具有重要临床价值。
Fischer GM, Maia-Silva D, Dias-Santagata D, Hornick JL, Russell-Goldman E. Undifferentiated Melanoma: A Clinicopathologic and Gene Expression Analysis Study With Identification of HMGA2 as a Diagnostic Marker. Am J Surg Pathol. 2025 Jul 9. doi: 10.1097/PAS.0000000000002452. Epub ahead of print. PMID: 40635241.