1198-梭形细胞/硬化性横纹肌肉瘤伴DCTN1::ALK融合：拓宽分子谱系及其潜在治疗意义
摘要
梭形细胞/硬化性横纹肌肉瘤（RMS）是新近明确的RMS变体，包含多种分子亚型。本文报道一例发生于10岁男童舌部的罕见病例，携带新型DCTN1::ALK融合基因。肿瘤呈浸润性生长，由梭形细胞束状排列伴局灶性漩涡结构构成，胞质嗜酸性，间质为胶原性或黏液样。可见中度细胞异型性、核分裂活性（2/10 HPF）及神经周围浸润。肿瘤细胞表达actin、desmin、MyoD1、myogenin及ALK。RNA测序检测到DCTN1外显子26与ALK外显子20的框内融合，经分裂读段验证并经FISH研究支持。该肿瘤表现为惰性病程，切除术后3年局部复发。本研究拓展了梭形细胞/硬化性RMS的分子谱系，该分子异常可能为不可切除或转移性疾病提供潜在治疗靶点。
引言
横纹肌肉瘤（RMS）作为最常见的儿童肉瘤（占儿童肿瘤5-8%），其特征为小圆蓝细胞或梭形细胞伴不同程度横纹肌分化，表达骨骼肌标志物（MyoD1、myogenin）。1992年Cavazzana等首次提出梭形细胞RMS，最初被视为胚胎性RMS的变体，好发于睾丸旁或头颈部区域。2013年WHO软组织和骨肿瘤分类将其确立为独立病种，其特征为梭形细胞束状排列伴嗜酸性胞质，通常呈低级别异型性，弥漫表达MyoD1但局灶表达myogenin，间质伴不同程度透明变性或硬化。该亚型占全部RMS的5-10%，可累及儿童及成人。目前认为梭形细胞/硬化性RMS是一种涵盖多种分子亚型的形态学模式，各亚型临床行为迥异：包括伴VGLL2/NCOA2重排的惰性婴幼儿/先天性亚型、伴MYOD1突变的高侵袭性亚型，或伴EWSR1/FUS::TFCP2/MEIS1::NCOA2融合的骨内亚型。本文首次报道儿童梭形细胞RMS中DCTN1::ALK融合基因的发现，这一分子改变可能具有重要诊断及治疗价值。
病史
10岁男童因舌背左侧3mm肿物就诊。切除活检初诊为”纤维瘤”。3年后肿瘤复发（12mm），再次行活检（图1A）。影像学检查显示肿瘤局限，无淋巴结或远处转移。行扩大切除并一期缝合，切缘阴性。患者术后4年言语及吞咽功能正常，无疾病证据。
病理学发现
三次标本复查显示相同形态学特征：肿瘤呈浸润性生长，中等细胞密度，位于舌表层肌束内，表面被覆完整复层鳞状上皮（图1B）。由梭形细胞束状排列伴局灶性漩涡结构，间质胶原性或黏液样，可见纤细/扩张血管及轻度淋巴细胞浸润（图1C-D）。梭形细胞核呈卵圆形/拉长/不规则，染色质深染，可见小核仁，胞质淡嗜酸性，未见明确横纹肌母细胞或胞质横纹（图1E）。核分裂象偶见（2/10HPF），可见神经周围浸润，未见坏死。
免疫组化
肿瘤细胞表达：
阳性：肌动蛋白（HHF-35, Cell Marque）、Desmin（D33, Dako）、MyoD1（EP212, Cell Marque）、Mgogenin（散在细胞,F5D, Cell Marque）
阴性：Calponin（EP798Y, Thermo Neomarkers）、h-caldeson（h-CD, Dako）、CD34（QBEnd10, Dako）、CD163（10D6, Leica）、S100（兔多克隆, Dako）、GFAP（6F2, Dako）、HMB45（HMB45, Dako）、AE1/AE3（AE1/AE3, Biogenex）（图2A-B） ALK免疫染色（p80, Novocastra）显示弥漫性胞质颗粒状阳性（图2C）。Ki67增殖指数10-20%。
分子检测
采用福尔马林固定石蜡包埋组织提取RNA（RNeasy FFPE kit, Qiagen），使用Illumina RNA泛癌panel构建文库，在NextSeq500测序仪（Illumina）进行75bp双端测序（300万读长）。通过RNA STAR v.2.4.0d比对hg19参考基因组，STAR Fusion v.0.5.4分析融合转录本并在IGV可视化。检测到DCTN1外显子26与ALK外显子20的框内融合，经3个跨融合转录本的分裂读段验证（图3A-B）。ALK基因自外显子20起持续表达，提示其受DCTN1基因从外显子20反式激活。荧光原位杂交（ALK断裂探针,Vysis）显示2p部分缺失导致的不平衡易位，肿瘤细胞中5′绿色探针信号丢失（图3C）。
MYOD1 L122区Sanger测序（引物：正向5′-CAAGGCGTGCAAGCGCA-3′/反向5′-CCTTGGGCAACCGCTGGT-3′）未发现突变。
图1 A 舌部轻度隆起性红斑病变，表面被覆完整上皮
B 肿瘤呈浸润性边界（右下象限可见包绕的良性骨骼肌）
C 致密梭形细胞束伴局灶黏液变区域
D 硬化区显示胶原性间质
E 肿瘤细胞核呈卵圆形/拉长/不规则，染色质深染伴明显小核仁，胞质嗜酸性量不等
图2 A MyoD1免疫组化显示肿瘤细胞弱-中度阳性
B Myogenin免疫组化显示散在肿瘤细胞阳性
C ALK免疫组化显示肿瘤细胞弥漫性胞质阳性
图3 A 三个分裂读段证实DCTN1外显子26与ALK外显子20的融合
B ALK基因（外显子16-24）表达水平：融合断点（外显子20）后持续表达
C ALK断裂探针FISH：肿瘤细胞显示一个融合信号、一个橙色信号（5′绿色信号缺失）
讨论
我们报道了一例发生于舌部的浸润性肿瘤，其梭形细胞具有嗜酸性胞质、轻至中度核多形性，并表达骨骼肌标志物（MyoD1表达范围显著大于myogenin），这些特征符合梭形细胞/硬化性横纹肌肉瘤（RMS）的诊断标准。需鉴别的疾病包括炎性肌纤维母细胞肿瘤（儿童常见肿瘤，50-60%存在ALK易位，含罕见DCTN1::ALK融合）。但本例肿瘤显示骨骼肌分化特征（嗜酸性而非双嗜性胞质），缺乏显著核仁及淋巴浆细胞浸润，且表达MyoD1与myogenin。浸润性生长和核异型性可排除中间型胎儿型横纹肌瘤。骨骼肌标志物阳性，同时组织细胞标志物、CD34、S100及特异性平滑肌标志物（h-caldesmon）阴性，可分别排除ALK阳性组织细胞增生症、ALK重排表浅性黏液样梭形细胞肿瘤及平滑肌肿瘤。
目前梭形细胞/硬化性RMS已明确多种分子亚型：
预后良好型：VGLL2/TEAD1::NCOA2/CITED2及SRF::FOXO1/NCOA1融合型，见于新生儿/婴儿，但可发生高级别转化或远处转移。
侵袭型：包括MYOD1 L122R突变型，以及EWSR1/FUS::TFCP2或MEIS1::NCOA2融合型，分别好发于软组织或骨组织。
其他罕见变异：YAP::MAML2、EP300::VGLL3、复合型MEIS1::NCOA2伴CAV1::MET扩增、HMGA2::NEGR1伴MDM2扩增、TPM3::NTRK1、SYPL1::BRAF及TOP2B::RAF1等。
约20-50%的RMS存在ALK蛋白表达（腺泡型多于胚胎型），多由ALK基因拷贝数增加导致，因此对ALK靶向治疗无反应。既往各有一例胚胎型和腺泡型RMS分别报道EML4::ALK融合及复杂ALK重排，但由于当时梭形细胞/硬化性RMS尚未被充分认识，其中胚胎型病例可能实属本亚型。TFCP2融合型梭形细胞/硬化性RMS中80-90%因ALK基因组部分缺失而表达ALK，但ALK易位此前未见报道。本研究首次发现DCTN1外显子26与ALK外显子20的融合，该融合保留了ALK受体酪氨酸激酶结构域。DCTN1（动力肌动蛋白亚基1）基因位于2p13染色体ALK基因上游，其编码的蛋白参与细胞内运输。DCTN1::ALK融合可能通过ALK蛋白二聚化引发自磷酸化及致癌。该融合曾报道于炎性肌纤维母细胞肿瘤、上皮样纤维组织细胞瘤、Spitz样肿瘤、肺腺癌、胰腺癌及髓单核细胞白血病，部分病例融合变体与本研究完全一致。一例DCTN1::ALK炎性肌纤维母细胞肿瘤患者对克唑替尼持续应答3年，后出现继发性ALK耐药突变。
综上，我们首次报道DCTN1::ALK融合阳性梭形细胞/硬化性RMS，拓展了该肿瘤的分子谱系。本例表现为惰性病程，单纯切除术后4年无淋巴结或远处转移。诊断挑战在于：儿童低级别梭形细胞肿瘤伴ALK表达易误诊为炎性肌纤维母细胞肿瘤，需通过骨骼肌标志物（尤其MyoD1）确诊。DCTN1::ALK融合可能为不可切除/转移性疾病提供治疗靶点。传统认为RMS需多模式治疗，但本例及其他惰性病例报道对此提出挑战，也反映当前分类的局限性。多学科会诊及个体化治疗可能是最佳选择。
Fung CK, Chow C, Chan WK, Choi EWK, To KF, Chan JKC, Cheuk W. Spindle cell/sclerosing rhabdomyosarcoma with DCTN1::ALK fusion: broadening the molecular spectrum with potential therapeutic implications. Virchows Arch. 2022 Apr;480(4):927-932. doi: 10.1007/s00428-022-03305-8. Epub 2022 Mar 1. PMID: 35229187.