1197-携带ZFP64::NCOA2/3融合的梭形细胞横纹肌肉瘤临床病理及分子遗传学特征：14例病例研究
摘要
梭形细胞横纹肌肉瘤（Spindle cell rhabdomyosarcomas，SCRMS）已被2020版WHO软组织和骨肿瘤分类确认为独立病种，其为一组具有梭形细胞形态的恶性骨骼肌肿瘤。目前该家族包括：
1）MyoD1突变型梭形细胞/硬化性横纹肌肉瘤（SCRMS/SRMS）；
2）携带FET::TFCP2或MEIS1::NCOA2融合基因的骨内SCRMS；
3）存在NCOA1/2或VGLL3重排的婴幼儿先天性SCRMS。
近期研究报道了一种罕见的新型SCRMS亚型，其特征为重复出现的ZFP64::NCOA3融合基因。本研究针对14例该罕见SCRMS亚型展开分析。患者包括11例男性和3例女性（中位年龄39.5岁；范围22-69岁），肿瘤部位涉及大腿（4例）、小腿（2例）、臀区软组织（2例）、腹壁（1例）、纵隔（1例）、第三肋骨骨膜下表面（1例）、声门（1例）、前列腺（1例）及骨盆（1例）。形态学上，11例肿瘤呈现均匀的梭形细胞形态伴束状结构，其余3例显示局灶性或优势性圆形细胞形态。2例病例可见广泛软骨-骨分化。免疫组化显示肿瘤细胞表达不均：同时表达Desmin与MyoD1（6例）、共同表达Desmin/MyoD1/Myogenin（1例）、单独表达Desmin（3例，其中仅1例完成MyoD1检测）或单独表达MyoD1（3例）。10例检测病例中6例表达SMA，5例检测病例中2例显示ALK表达。基因检测发现8例存在ZFP64::NCOA3融合，6例为ZFP64::NCOA2融合。甲基化研究表明除1例外，所有检测肿瘤形成紧密聚类，明显区别于其他RMS亚型及非RMS形态学相似病变。
临床随访资料（14例中10例；中位时间35个月；范围3-108个月）显示2例局部复发，5例发生远处转移（中位时间12个月；范围：初诊时-106个月）。末次随访时，5例患者无病生存，3例带病生存，2例分别于34个月和108个月因疾病死亡。
我们得出结论：携带ZFP64::NCOA2/3融合基因的SCRMS是一种独特的临床侵袭性肉瘤，其特征表现为束状结构（偶见圆形细胞形态）、局灶性软骨-骨分化以及程度不等的骨骼肌标志物表达。明确认识这一新兴SCRMS亚型可能具有预后判断与治疗指导意义。
引言
除作为融合驱动型横纹肌肉瘤（RMS）典型代表的腺泡状横纹肌肉瘤（ARMS）外，近年来还发现一系列具有横纹肌分化特征的新兴肿瘤类型，这些肿瘤全部或部分由重复性基因融合所定义。此类融合驱动型肿瘤通常表现为梭形细胞形态，在第五版WHO软组织和骨肿瘤分类中被归为”梭形细胞横纹肌肉瘤”（SCRMS）的亚型。
目前明确的SCRMS家族包括：
MYOD1 p.L122R突变的”梭形细胞/硬化性横纹肌肉瘤”（SC/SRMS）
先天性/婴幼儿型SCRMS（临床呈惰性，特征性涉及VGLL2、NCOA2、SRF、TEAD1和CITED2等基因重排）
具有侵袭性临床行为的SC/上皮样RMS（特征性携带FET::TFCP2或罕见MEIS1::NCOA2融合，好发于颅面骨）
2022年Han等首次报道5例具有成人型纤维肉瘤样鱼骨样排列特征的SCRMS，均携带ZFP64::NCOA3融合。截至目前，仅另有3例类似病例报道（2例ZFP64::NCOA2融合，1例ZFP64::NCOA3融合）。本研究通过14例ZFP64::NCOA2/3融合型SCRMS的系列研究，进一步拓展了该亚型的临床病理及分子遗传学谱系。
材料与方法
病例收集
经各参与机构伦理委员会批准，从档案中检索出14例携带ZFP64::NCOA2或ZFP64::NCOA3融合的SCRMS。其中2例（病例10和12）通过公共甲基化数据集鉴定，曾分别被诊断为恶性外周神经鞘瘤（MPNST）和伴横纹肌分化的MPNST。复阅所有切片及免疫组化结果，从病历资料中收集年龄、性别、治疗、复发转移及随访数据。病例2、3和13已发表，本研究补充其随访资料，并对病例2和3进行追加分子检测。
免疫组化
采用标准技术对4μm FFPE切片进行检测。阳性判定标准：
局灶（+）：<10%细胞着色
中度（++）：10-49%细胞着色
弥漫（+++）：≥50%细胞着色
RNA测序
TruSight RNA Pan-Cancer Panel（Illumina）：病例1、5
Archer panel：病例2、4、7、9-11、14
XR panel（TEMPUS）：病例12
Mayo Clinic SARCP20：病例6、8、13
UPMC Oncomine+光学基因组作图（病例3）
甲基化检测
采用Infinium Human-Methylation EPIC（850K）或EPIC v2.0（940K）芯片平台。数据分析流程：
使用R包”minfi”预处理，EPICv2.0数据转换为虚拟850K阵列统一处理
剔除SNP相关探针及性染色体探针
采用”preprocessQuantile”函数降维可视化，”preprocessIllumina”函数生成拷贝数图谱
通过R包”ChAMP”校正批次效应
基于25,000个高变CpG位点进行PCA-UMAP分析
使用R包”conumee”推断拷贝数变异（参数：每bin≥50探针，bin大小≥100kb）
光学基因组作图（OGM）
从新鲜肿瘤组织提取超高分子量DNA
DLE-1酶+DL-Green荧光标记（Bionano Genomics）
Saphyr G3芯片纳米通道成像
Bionano Access（v1.7.1/1.8.2）和Solve（v3.7.1/3.8.2）分析结构变异（SV）与拷贝数变异（CNV）
Rare Variant Pipeline：检测低等位基因分数体细胞SV
CNV Pipeline：识别染色体数目异常及局灶拷贝数改变
结果
临床特征 14例患者中男性11例，女性3例，中位年龄39.5岁（范围22-69岁）。肿瘤部位分布：大腿4例、小腿2例、臀部软组织2例、腹壁1例、纵隔1例、第三肋骨骨膜下1例、声门1例、前列腺1例、盆腔1例，中位肿瘤大小10.9cm（3.5-22.0cm）。13例治疗信息显示：6例单纯手术切除，5例新辅助化疗/放疗后手术，2例术后辅助治疗。中位随访35个月（3-108个月）的10例患者中，5例无病生存（其中仅1例接受辅助治疗），3例带瘤生存（含2例局部复发伴肺转移），2例肿瘤相关死亡（1例106个月后肺转移）。
形态学特征 肿瘤多呈界限清楚的深在性肿块（图1），由均匀梭形细胞束状排列构成，伴不同程度胶原硬化。12例可见鱼骨样排列结构，2例（病例6、8）以圆形细胞为主。2例（病例4、12）伴显著软骨-骨分化（图5），易误诊为恶性外周神经鞘瘤伴异源性分化。核分裂象1-74/10HPF（中位数4），5例见局灶至广泛坏死。
免疫组化结果 13例显示骨骼肌分化证据：结蛋白与MyoD1双阳性6例，Desmin/MyoD1/Myogenin三阳性1例，仅Desmin阳性3例，仅MyoD1阳性3例。6/10例SMA局灶阳性，2/5例ALK表达（1例弥漫性）。值得注意的是，圆形细胞为主的病例6表现为AE1/AE3/CAM5.2强阳性（＞50%细胞），而骨骼肌标志物仅局灶表达。
分子遗传学发现 RNA测序显示：ZFP64 exon5::NCOA2 exon14融合6例（43%），ZFP64 exon5::NCOA3 exon14/15融合8例（57%）。附加变异包括：病例3检出TP53突变伴1q（mTOR位点）和13q（Rb位点）缺失（图8）；病例14存在CDKN2A/B、TP53、MTAP和GNAS突变。
甲基化分析 10例甲基化谱分析显示，9例形成独立聚类，与其它横纹肌肉瘤亚型显著区分；病例6因可能携带DICER1缺失（甲基化数据提示但未验证）与DICER1突变型RMS聚为一类。该结果证实ZFP64融合型SCRMS是具有独特表观遗传特征的肉瘤亚型（图7）。
图1：病例2（A-C）和病例4（D-F）的典型影像学表现
A-C：CT轴位（A）和钆增强脂肪抑制MRI（B）显示左侧第3肋骨表面部分钙化的T2高信号不均匀强化病灶（C为大体标本）
D-F：病例4的CT显示大腿近端巨大软组织肿块伴广泛基质钙化（D-E），对应MRI呈T2加权像不均匀高信号（F）
图2：ZFP64::NCOA2/3融合型SCRMS的组织结构特征
A：深在性界限清楚的肌内肿瘤
B：周边骨骼肌局灶浸润
C：偶见外周淋巴细胞聚集
D-E：病例5和13显示粘液样基质伴散在脂肪细胞
F：病例2（左前肋表面肿瘤）低倍镜观
图3：ZFP64::NCOA2/3融合型SCRMS的形态学特征
A-C：无序排列的梭形细胞窄束（病例7/5/11）
D：常见鱼骨样排列（病例7）
E：鹿角型血管增生（病例1）
F：肿瘤细胞与透明变胶原交替分布（病例2）
G：活跃的核分裂象（病例2）
图4：三例以圆形细胞为主的SCRMS特征
A-C：病例6显示圆形细胞区与温和梭形细胞/脂肪细胞移行（A），原始圆形细胞片状分布（B）及核分裂活跃（C，箭头）
D-F：病例8混合梭形（D）与圆形细胞（E），伴透明变胶原区（F）
G-I：病例10显示大片坏死（G），血管外皮瘤样血管（H）及低-高级别形态突然转变（I，箭头与箭头头）
图5：伴显著软骨-骨分化的肿瘤表现
A-B：病例4广泛骨性（A）与软骨分化（B）
C：梭形细胞区与本系列其他病例相同
D：无异型性的骨/软骨结节符合化生性改变
E-F：病例12显示梭形细胞与软骨-骨分化区交替
图6：免疫组化结果
A-B：病例2弥漫表达结蛋白（>50%细胞）和MyoD1
C-E：病例4局灶结蛋白（<10%细胞）与弥漫MyoD1表达
F：病例13ALK弥漫阳性
G-H：病例6AE1/AE3弥漫阳性与结蛋白局灶阳性
图7：甲基化分析UMAP图
显示所有检测肿瘤与各参照肉瘤（包括腺泡型/胚胎型RMS、DICER1突变肉瘤等）的表观遗传聚类关系。除1例与DICER1突变肉瘤相似（箭头）外，本研究肿瘤形成独立紧密簇群。
图8：病例3的光学基因组作图结果
A：涉及ZFP64::NCOA2融合的t(8;20)相互易位Circos图（外至内环依次显示：细胞带、结构变异、拷贝数变异和易位轨迹）
B：ZFP64::NCOA2融合的染色体审查
C：全基因组拷贝数变异视图（蓝色条指示1/3/5/6/8/11-22号染色体增益）
讨论
过去十年间，随着靶向RNA测序技术的广泛应用，融合驱动型横纹肌肉瘤的谱系显著扩展。除作为典型融合驱动RMS的腺泡状横纹肌肉瘤（多携带PAX3/7::FOXO1融合基因）外，其他罕见融合驱动型RMS也日益受到关注，包括一组具有高度侵袭性的梭形与上皮样RMS（携带FET::TFCP2及少数MEIS1::NCOA2融合基因）。在预后良好的先天性/婴幼儿SCRMS中，也报道了涉及NCOA2、VGLL2、TEAD1及CITED2基因的融合。此外，近期研究发现另一组所谓的SCRMS（好发于成年男性头颈部）存在重复出现的VGLL3融合，并呈现惰性临床过程。本团队曾报道6例软组织融合驱动型梭形细胞RMS，这些肿瘤缺乏统一的形态学、免疫组化及分子遗传特征，目前尚不明确应将其归类为“梭形细胞横纹肌肉瘤”的变异，还是仅因部分骨骼肌表型而归类的独立病种。我们前期系列病例中有一例携带新型ZFP64::NCOA2融合，其与Han等人报道的5例ZFP64::NCOA3融合SCRMS病例具有显著相似性。
包括本研究14例肿瘤在内，目前共报道19例携带ZFP64::NCOA2/3的SCRMS（表1）。这些肿瘤呈现明显男性好发倾向（15例男性，占79%；4例女性，占21%），最常见于中年患者（中位年龄41岁；范围22-81岁）。虽然部分肿瘤起源于骨表面、浸润骨组织或显示化生性骨形成，但迄今为止所有报道病例均主要发生于软组织。携带ZFP64::NCOA2/3融合的SCRMS最常累及下肢（特别是大腿/臀部区域），其次为躯干，但也有声门甚至前列腺、腹膜或纵隔等内脏部位的不常见病例报道，提示其具有广泛的解剖分布范围。临床上该类肿瘤具有侵袭性，53%的病例发生远处转移（中位时间：11个月；范围：初诊时-106个月），13%的病例出现局部复发（中位时间：69个月；范围：22-116个月）。截至最近一次随访（中位时间24个月；3-108个月；15例患者），27%的患者因疾病死亡，另有27%带病生存，仅46%无病生存。
总体而言，涉及NCOA3基因座的融合约为NCOA2融合的两倍。根据我们的观察，无论NCOA旁系同源基因作为3’端伴侣如何，ZFP64融合SCRMS在形态学、免疫组化或临床特征方面均未见明显差异。NCOA2和NCOA3属于类固醇受体共激活因子p160/SRC家族，已在多种融合驱动型肿瘤亚型中报道，包括某些白血病、先天性/婴幼儿梭形细胞RMS、骨内梭形细胞RMS、携带MEIS1::NCOA2融合的软组织RMS以及罕见的腺泡状RMS病例。此外，NCOA1/2/3是SRF重排肌样肿瘤、多种子宫间叶性肿瘤、间叶性软骨肉瘤以及各类谱系未明肿瘤（如软组织血管纤维瘤、新近描述的“低级别纤维母细胞性梭形细胞肿瘤”和携带PRRX1::NCOA1/2融合的纤维母细胞性肿瘤）中常见的融合伴侣。近期已有关于NCOA3作为潜在药物靶点的初步数据发表，这可能具有治疗指导意义。
涉及NCOA2/3基因的融合通常导致编码NCOA2/3与激素受体及靶向特异性转录复合物其他成员相互作用基序的N端外显子丢失，而保留C端附近的核受体共激活结构域完整。因此，在NCOA2/3融合相关肉瘤中，通常由5’端融合伴侣指导嵌合蛋白的DNA结合与靶向定位，而残留NCOA2/3编码结构域的功能被假设为参与这些靶标的转录反式激活。因此，上述生物学特性多样的NCOA1/2/3重排肿瘤的分化与行为可能不仅取决于细胞起源，还取决于5’端伴侣及其转录程序。
一小部分ZFP64::NCOA2/3融合SCRMS显示广泛钙化区和/或化生性骨或软骨，这对其当前作为RMS的分类提出了质疑。对这些异常特征及有时不一致的骨骼肌标志物表达的一种合理解释基于ZFP64在间充质细胞分化中的作用。体外实验表明，ZFP64可作为Notch1的共激活因子，从而抑制成肌细胞中的肌源性分化，并促进成骨细胞分化。因此，这些肉瘤可能起源于肌肉卫星细胞或成肌细胞，其中ZFP64::NCOA2/3融合 actively抑制肌源性分化。在这种情况下，具有异源成分的肿瘤细胞比仅显示未分化“成纤维细胞样”表型的细胞经历了更深刻的表观遗传重编程。还需注意的是，软骨-骨分化也常见于其他具有横纹肌样分化的肿瘤，如恶性蝾螈瘤和子宫癌肉瘤，以及DICER1突变的横纹肌肉瘤样肉瘤，这提示存在允许 divergent分化的共同早期转录程序。
由于半数检测病例表达两种或更多横纹肌源性标志物（尽管表达程度差异显著），且所有病例至少局灶性表达一种肌源性标志物，我们认为这种一致的横纹肌母细胞分化证据最有力地支持先前提出的SCRMS分类建议。然而，我们也认识到这一命名可能未完全反映这些肿瘤的复杂生物学特性，这与肉瘤病理学中许多其他范例（如滑膜肉瘤）相似。
本队列中一例肿瘤（病例6）显示独特的形态学、免疫表型和表观遗传特征，提示其可能代表独立病种或另一种具有变异融合的肉瘤类型。在甲基化分析中，该肿瘤与DICER1相关RMS聚类的现象，且基于甲基化数据的拷贝数分析提示其可能也存在DICER1基因座缺失（尽管缺乏材料验证这一发现）。虽然我们根据局灶性Desmin表达将其归类为ZFP64融合SCRMS，但弥漫性角蛋白表达可能提示其他诊断，如携带新型融合的促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤（DSRCT）。该肿瘤在甲基化谱分析中未与DSRCT对照队列聚类。最终需要更多病例以深入理解这一独特案例。尽管该病例属于异常值，我们仍将其纳入研究，以期提高对仅依赖融合识别或甲基化分类器诊断罕见肿瘤所面临特定挑战的认识。希望本文描述能助于识别类似病例，进一步阐明该肿瘤的本质。
由于ZFP64融合SCRMS可能同时显示梭形和圆形细胞形态以及软骨-骨分化，间叶性软骨肉瘤应考虑作为鉴别诊断。然而，间叶性软骨肉瘤的梭形细胞通常较SCRMS的细长细胞更短小，且因相较于大多数SCRMS病例更显著的鹿角状血管网而呈现更无序的排列。虽然两种肿瘤均涉及NCOA2基因融合，但间叶性软骨肉瘤中的HEY1::NCOA2嵌合蛋白已被证明特异性结合HEY1靶基因启动子，产生表观遗传学独特的肿瘤，我们的甲基化研究也证实了这一点（见图7）。
对于更呈梭形的ZFP64融合SCRMS病例，其他重要的形态学鉴别诊断包括多种束状梭形细胞肉瘤，如恶性外周神经鞘瘤（伴横纹肌分化）、纤维肉瘤样隆突性皮肤纤维肉瘤（FS-DFSP）、所谓的激酶改变型梭形细胞肿瘤和单相型滑膜肉瘤。值得注意的是，本组两例病例曾作为恶性外周神经鞘瘤和恶性蝾螈瘤发表。特别是在无1型神经纤维瘤病史或明确神经起源证据时，应谨慎诊断恶性蝾螈瘤，并考虑ZFP64::NCOA2/3驱动的SCRMS。幸运的是，除分子确认外，H3K27三甲基化的保留是一个有用的标志物，也可作为反对恶性蝾螈瘤诊断的依据，因后者通常显示H3K27三甲基化缺失。
FS-DFSP可通过其好发于浅表部位、缺乏骨骼肌标志物、CD34可变表达以及存在PDGFB或罕见PDGFD重排排除。具有NTRK1/2/3、RAF1、MET、ALK、BRAF或EGFR融合的激酶改变型梭形细胞肿瘤具有广泛的形态谱，其中部分肿瘤显示类似纤维肉瘤或恶性外周神经鞘瘤的形态模式。免疫表型上，这些肿瘤通常表达CD34和/或S100；pan-TRK与NTRK1-3融合的存在不完全相关。ALK重排肿瘤通常显示ALK过表达。滑膜肉瘤常显示无序束状生长，有时伴化生性骨形成或钙化，但骨骼肌标志物表达的缺失和SS18::SSX1-4融合的存在有助于排除该鉴别诊断。
总之，我们报道了14例ZFP64::NCOA2/3驱动SCRMS的临床病理、免疫组化和分子遗传特征。这些肿瘤最常表现为透明胶原背景中的束状梭形细胞形态，偶见化生性基质产生，以及可变但一致的骨骼肌标志物表达。罕见病例可包含局灶或弥漫圆形细胞形态区域。表观遗传学上，它们通常形成独立于其他RMS类型和束状梭形细胞肉瘤的紧密聚类，进一步支持其作为独立肿瘤实体。鉴于其常表现为侵袭性临床过程，包括频繁远处转移、局部复发和疾病相关死亡，准确识别这些肿瘤对深入理解其行为与预后、改善患者管理至关重要。
总结：
随着靶向RNA测序技术的广泛应用，融合驱动型横纹肌肉瘤（RMS）的谱系在过去十年显著扩展。除典型的PAX3/7::FOXO1融合型腺泡状RMS外，一系列新型融合驱动RMS逐渐被认识，包括具有高度侵袭性的梭形/上皮样RMS（伴FET::TFCP2或罕见MEIS1::NCOA2融合）以及预后良好的先天性/婴幼儿型SCRMS（伴NCOA2、VGLL2、TEAD1或CITED2融合）。本研究通过14例ZFP64::NCOA2/3融合型SCRMS的系统分析，结合既往报道的5例病例，揭示该亚型具有以下特征：
临床病理特征
人口学特点：显著男性倾向（15例男性，79%），中位年龄41岁（22-81岁）
解剖分布：好发于下肢（尤其大腿/臀部）及躯干，偶见于声门、前列腺等特殊部位
生物学行为：53%发生远处转移（中位时间11个月），13%局部复发，27%肿瘤相关死亡
分子机制
融合模式：NCOA3融合（57%）约为NCOA2融合（43%）的2倍，二者在形态学、免疫表型及临床行为上无显著差异
致病机制：ZFP64::NCOA2/3融合导致NCOA2/3蛋白N端结构域缺失，保留C端核受体共激活域，其转录程序由5’端ZFP64驱动
分化异常：ZFP64通过Notch1通路抑制肌源性分化、促进成骨分化的特性，可解释部分病例出现软骨-骨分化及骨骼肌标志物表达不一致的现象
诊断与鉴别诊断
关键诊断线索：束状排列的梭形细胞、透明变胶原背景、至少局灶性骨骼肌标志物表达
主要鉴别诊断：
间叶性软骨肉瘤：短梭形细胞无序排列伴显著”鹿角状”血管网，特征性HEY1::NCOA2融合
恶性蝾螈瘤：需结合神经纤维瘤病病史及H3K27me3缺失检测
纤维肉瘤型隆突性皮肤纤维肉瘤：浅表发病、CD34表达及PDGFB重排
激酶融合梭形细胞肿瘤：CD34/S100表达、特定激酶基因重排
单相型滑膜肉瘤：SS18::SSX融合及缺乏肌源性标志物
特殊病例启示
1例伴圆形细胞形态及角蛋白弥漫表达的肿瘤（病例6）在甲基化分析中与DICER1突变型RMS聚类，提示可能存在生物学本质差异。该病例凸显了在罕见肿瘤诊断中，单纯依赖融合基因检测或甲基化分类器的局限性。
临床意义
ZFP64::NCOA2/3融合型SCRMS是具有独特表观遗传特征的侵袭性肉瘤亚型。鉴于其高转移率与不良预后，准确识别对该类患者的预后评估及靶向治疗（如针对NCOA3的靶点开发）具有重要意义。本研究通过多组学分析为这一新兴实体提供了充分的分子病理学依据。
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