微精选

【导读】

    社会心理压力影响人体免疫系统与大脑正常功能。大量临床前和临床研究已将外周免疫系统改变与重度抑郁症 (MDD) 等压力相关疾病联系起来，但其潜在机制尚不十分清楚。Scott.J.Russo的团队发现在患有MDD的人的血清中以及在慢性社交挫败压力模型 (CSDS) 后的应激易感小鼠中，循环系统中髓系细胞特异性的基质金属蛋白酶 8 (MMP8) 的表达增加。这种改变导致细胞外空间的改变和伏隔核 (NAc) 的神经生理变化、以及社会行为的改变。抑制MMP8可预防应激诱导的社交回避行为以及NAc神经生理学和细胞外空间的改变。该原著论文于2024年发表于Nature。

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01 研究背景

    重度抑郁症（MDD）全球发病率高且缺乏有效治疗手段，超过三分之一的患者在使用现有的抗抑郁药物或成熟的心理治疗方法后仍然无法完全缓解。社会心理压力是MDD的致病原因之一。阐明社会心理压力如何导致MDD，对于加深对MDD等疾病的理解并最终制定治疗方案和预防策略至关重要。

    心理社会应激可显著影响中枢神经系统（CNS）与外周器官之间的免疫相互作用。慢性应激可激活先天免疫系统，引发外周髓系细胞（例如单核细胞和中性粒细胞）的动员，以及促炎性细胞因子的产生。MDD患者多呈现慢性低度炎症状态，其循环中促炎性细胞因子水平升高，白细胞增多。此外应激还会破坏小鼠的血脑屏障（BBB）内皮，使得循环中的蛋白质更容易直接进入大脑奖赏区域（如伏隔核，NAc）。

    在大脑中，神经元和非神经元细胞由细胞外空间（ECS）分隔开来，细胞外空间中包含有间质液以及由神经元和胶质细胞分泌的蛋白质和聚糖构成的致密支架——细胞外基质（ECM）。研究表明，ECM 分子在维持大脑稳态的过程中发挥着重要作用，包括在调节突触功能中的作用。ECM的降解和重塑由多种酶调控，例如基质金属蛋白酶（MMPs）。循环中的 MMPs已被证实与多种炎症过程和疾病相关，如癌症和心肌梗死。尽管已有多项研究提示中枢神经系统的 MMPs可通过改变ECM组分影响突触重塑和传递，但在心理社会应激背景下，外周免疫来源的MMPs对中枢的作用仍知之甚少。

    Scott.J.Russo创立并领导 Mount Sinai 的“Brain & Body Research Center”（脑与身体研究中心），推动一种“整体性”研究范式，解码大脑与心脏、肠道、免疫等身体系统之间的对话与协作机制。中心协作领域包括：压力如何促使炎症因子进入中枢影响行为、特定脑区如何控制外周免疫细胞功能，以及应激对血管内皮的损伤机制等。这篇文章代表了其研究团队的一个核心方向。

02 重要研究结果

    人际冲突和社会霸凌是常见的心理应激源，可能诱发重度抑郁发作。为了研究心理社会应激对免疫系统的影响以及它如何作用于大脑，研究者采用了经典的社交应激模型——CSDS（chronic social defeat stress，慢性社交挫败压力）模型范式。实验小鼠在 10天内通过身体接触和感官暴露，被一只具有攻击性的CD-1小鼠压制。在多数受打压小鼠中，会出现社会回避以及对自然奖赏（快感缺失，包括社会奖赏受损）偏好下降的行为表型。同时还会出现多种生理紊乱，如代谢综合征、系统性炎症和胃肠道紊乱。这类小鼠被称为应激易感（SUS）小鼠。然而，也有一部分小鼠在行为和生理表现上与未受打压的对照（CON）小鼠相似，这些小鼠被称为应激不易感（RES）小鼠。

    区分两组小鼠之后，研究者利用质谱流式细胞术（CyTOF，cytometry by time-of-flight）对 CON、SUS 和 RES 小鼠外周循环和脑内的免疫细胞进行了高维表型分析，发现在血液中，CSDS在SUS和RES小鼠中均导致炎症性Ly6C^hi单核细胞（促炎型单核细胞）和中性粒细胞数量增加，以及B细胞数量减少。

    为了探究这些临床前小鼠研究结果是否可延伸到人类压力相关疾病中，研究者又检测了MDD患者与健康对照者的血液白细胞亚群，发现MDD患者存在白细胞增多症，其单核细胞和中性粒细胞数量增加，而淋巴细胞（包括总B细胞、初始B细胞、过渡性B细胞和记忆B细胞）没有差异。研究者还观察到，循环中单核细胞和中性粒细胞的数量与感知压力量表（Perceived Stress Scale，一种临床验证的自评压力量表）评分之间存在显著正相关。

    为了排除外周白细胞的影响，研究者去除小鼠脑膜，并用PBS充分灌流脑组织。随后检测了整个小鼠大脑中CSDS后的白细胞，发现SUS小鼠中促炎性 Ly6C^hi单核细胞特异性增加，而RES小鼠则没有。值得注意的是，其他白细胞或脑内固有免疫细胞（如小胶质细胞或边界相关巨噬细胞）并未在CSDS后出现差异。能进入脑的外周白细胞数量有限，以单核细胞为主，且数量不多，需同时兼顾细胞的可回收性。研究者使用普通流式细胞术检测了CSDS后小鼠在软脑膜、硬脑膜和脉络丛中的白细胞亚群（单核细胞、中性粒细胞、B细胞和T细胞）。与CON小鼠相比，在软脑膜中，仅SUS小鼠单核细胞增加；而在硬脑膜中，SUS和RES小鼠均有增加。脉络丛中单核细胞的比例没有变化。

    为了研究CON、SUS和RES小鼠主要循环白细胞亚群在应激诱导下转录变化的差异，研究者对Ly6C^hi 单核细胞、Ly6C^low单核细胞、B细胞和T细胞进行了细胞类型特异性RNA测序（利用流式细胞术将细胞分选之后然后把这些纯化的细胞群体分别做整体RNA提取和转录组测序）。CSDS诱导的基因表达变化在 Ly6C^hi单核细胞中最为显著：SUS与CON小鼠相比共有785个差异表达基因，RES与CON小鼠相比有311 个差异表达基因（调整后的P值<0.05且log2倍数变化 >|1|），而其他细胞类型的差异表达基因数量约少10倍。随后，研究者进行了GO富集分析。SUS与CON小鼠相比上调的基因涉及的GO生物过程包括先天免疫应答（GO:0045087）和炎症反应（GO:0006954），细胞组分包括细胞外空间（ECS，GO:0005615）。

    综上，CSDS增加了循环及脑内的单核细胞数量，并在SUS小鼠中诱导出促炎性的转录特征。这些结果强调了外周髓系细胞在MDD等压力相关疾病中的作用，与多项临床前研究以及人类研究的结论一致。因此，研究者接下来聚焦于阐明外周单核细胞影响神经元功能和行为的机制。

Fig1. 压力会增加血液循环和大脑中的单核细胞数量，并在 SUS小鼠的单核细胞中诱导促炎转录特征

    首先，研究者利用全脑组织透明化方法iDISCO+ 对单核细胞进行了详细的解剖定位，确定了炎症性 Ly6C^hi单核细胞在大脑中迁移的确切位置。这里研究者使用了Ccr2^rfp报告小鼠。CCR2是促炎单核细胞常表达的趋化受体（对趋化因子CCL2/MCP-1敏感，会被吸引去炎症部位），Ccr2^rfp报告鼠在CCR2启动子下表达RFP，能标记/追踪CCR2+的炎症型单核细胞。研究者对来自CON、SUS和RES小鼠的大脑进行透明化处理，然后进行光片显微镜成像，并使用 ClearMap将样本绘制到艾伦脑图谱（Allen Brain Atlas）中，把每个检测到的细胞归属到特定的脑区标签。

    研究者分析了整个大脑中的细胞总数，确认了先前得到的 CyTOF 数据，即仅在SUS小鼠大脑中单核细胞数量增加，并且该增加与社交互动（SI）比率呈负相关。接下来，研究者检查了特定脑区中单核细胞与社交回避行为的相关性。边缘系统脑区（如伏隔核，NAc）中的细胞计数与SI比率高度相关，NAc中单核细胞数量越多，社交回避行为越严重。NAc是一个应激反应性脑区，核心作用是处理奖赏性和厌恶性刺激，并且在抑郁症症状的介导中至关重要。与NAc相比，单核细胞向前额叶皮层（PFC）的迁移并未增加，也没有发现PFC中单核细胞数量与SI比率之间存在显著相关性。共聚焦显微镜结果显示，单核细胞附着在NAc的血管上，但并未进入脑实质或血管周围间隙。综上，单核细胞进入大脑后集中在NAc附近，NAc中的单核细胞计数与社交回避行为呈显著正相关。

    那么脑迁移单核细胞是如何促进应激诱导的社交回避的呢？研究者对CSDS后对脑迁移单核细胞进行了单细胞RNA测序。对Ccr2^rfp+单核细胞进行的无监督聚类分析，根据其转录特征揭示了四个独特的簇。簇 0在SUS小鼠中相对于CON和RES小鼠更为富集。为了确定簇特异性基因，研究者进行了差异基因表达分析，比较了各簇与所有基因之间的差异（调整后P值 <0.05）。在簇0中发现多种与炎症过程相关的基因上调，例如编码S100蛋白的基因，包括S100A6和 S100A11，溶菌酶（Lyz1，一种对宿主防御至关重要的抗菌蛋白），以及连接蛋白（Anxa1 和 Anxa2）。对簇0上调基因进行的GO分析显示其参与氧化–还原过程（GO:0055114）、细胞外空间（ECS，GO:0005615）和细胞外基质（ECM，GO:0031012）。这些ECS和ECM通路中表达差异最显著的基因之一是Mmp8，其编码基质金属蛋白酶 8。值得注意的是，Mmp8也是SUS与CON小鼠循环 Ly6C^hi单核细胞中差异表达最显著的基因之一，与 GO “细胞外空间”分析结果也是如此。SUS 小鼠的脑软膜、硬脑膜或脉络丛单核细胞中Mmp8基因表达没有增加，这表明脑中MMP8来源可能是循环单核细胞。

    研究者进一步对NAc中的脑驻留免疫细胞进行了单细胞RNA测序，但没有观察到与应激相关的稳态或炎症基因特征的变化。先前有其他对小鼠的研究报道了应激诱导的形态学、转录和功能变化，表明其他脑区的小胶质细胞存在炎症，本文是首次在单细胞水平研究NAc小胶质细胞的细胞类型特异性基因表达特征。这一发现提示不同脑区的小胶质细胞对应激的反应存在特异性差异。这些结果与近期在MDD患者死后脑样本中进行的单细胞研究一致，均未发现小胶质细胞呈现促炎型特征。这暗示在MDD的病理机制中，小胶质细胞可能不是主要的促炎来源，炎症更多可能来自外周单核细胞、中性粒细胞等。

    MMP8属于胶原酶家族，主要由中性粒细胞和单核细胞产生和分泌。活化的MMP8能够切割多种ECM 成分，如胶原蛋白、纤连蛋白、tenascin和聚集蛋白（aggrecan），其中许多是脑ECM的组成部分。本文的研究数据和既往研究表明，与许多其他MMP不同，MMP8不由任何中枢神经系统细胞（包括脑驻留髓系细胞）产生或分泌。在一项全血基因表达研究中，与健康对照组相比， MMP8是MDD患者中上调最多的基因之一。此外，Mmp8编码区的单核苷酸多态性与MDD有关。然而，将MMP8与MDD联系起来的潜在机制尚未被探究。

Fig2. SUS 小鼠脑运输 Ly6C^hi单核细胞中基质金属蛋白酶8 mRNA（Mmp8）表达增加

    结合测序数据，研究人员验证了CSDS后小鼠循环和大脑中MMP8的蛋白水平变化。他们首先证实了 CSDS后血浆中MMP8蛋白水平受应激诱导而增加，并且MMP8水平与SI比率呈负相关。10天的CSDS和21天的慢性可变应激均会增加雌性小鼠的血浆MMP8水平。为了进一步验证MMP8的独特性，研究者测量了同一只小鼠在CSDS 10天后血浆中其他MMP蛋白的水平，例如MMP2、MMP3、proMMP9和 MMP12。虽然观察到MMP3有适度升高，但这种变化在SUS和RES中都与CON相似，这确认了只有 MMP8在SUS组中特异性上调。CSDS后小鼠的大脑中，SUS小鼠的NAc中MMP8水平上调，PFC未受影响。最后，研究者验证了人体中的情况是否与小鼠研究相符合。结果显示，MDD患者血清中的MMP8较健康对照升高，其水平与自我报告的感知应激呈正相关。

    那么MMP8是否会促进应激易感性呢？研究者向应激易感小鼠的眶后注射生物素化的小鼠重组MMP8（rMMP8），发现外周MMP8可以进入脑实质。MMP8如何进入脑实质是一个重要的问题。Scott的实验室前期研究发现，与RES和CON小鼠相比，CSDS导致SUS小鼠内皮紧密连接蛋白Claudin 5 (CLDN5) 表达降低和BBB通透性增加。因此，研究人员假设MMP8可能通过受损的BBB进入大脑。为了证明这一点，研究人员通过立体定位注射腺相关病毒（AAV）载体，在NAc中敲低Cldn5表达（AAV-shRNA-Cldn5）或注射对照的非靶向 shRNA（AAV-shRNA）。在亚阈值社交失败给小鼠制造一个临界状态后，研究者将生物素化的rMMP8从眼眶后注射到循环中，看它是否能推动小鼠从“未患病”跨过阈值进入“应激易感”状态。之后用PBS彻底灌注小鼠脑以去除循环中的rMMP8，并对rMMP8进行免疫组织化学染色和定量。结果显示，与注射非靶向载体的小鼠相比，敲低Cldn5会增加脑实质中生物素化的rMMP8 水平。

    然后，研究者评估了CSDS是否影响大脑的 ECS。利用透射电子显微镜成像（TEM）评估CSDS后小鼠的NAc和PFC组织切片的ECS百分比，与无应激对照组相比，SUS小鼠的NAc中的ECS体积分数增加， PFC中没有观察到任何组差异。在其他中枢神经系统疾病（如神经退行性疾病）中，也曾报告过ECS体积分数增加，这种变化可能是由细胞外基质（ECM）降解导致的细胞连接受损引起的。值得注意的是，NAc 中ECS体积分数与外周MMP8水平呈正相关，而PFC 中没有这种关系。

    MMP8已被证明可蛋白水解降解聚集蛋白聚糖（aggrecan）——这是ECS的重要蛋白，可与透明质酸等糖胺聚糖及其他糖蛋白结合在神经元和胶质细胞表面，从而在组织ECS结构中起关键作用。慢性疼痛小鼠模型的研究显示，海马中MMP8升高与 aggrecan减少及ECM结构变化相关。因此，研究者进一步量化了CON、SUS和RES小鼠的NAc中的aggrecan，发现SUS小鼠相比CON小鼠明显下调，且aggrecan水平与SI比值呈正相关，与外周MMP8 水平呈负相关。

    最后，为了测试直接改变ECS是否会影响社会行为，研究者在NAc中植入了双侧套管，为了模拟 CSDS的慢性特性，每天输注一次透明质酸酶（一种透明质酸降解酶）或载体，持续10天。透明质酸酶可分解ECM中的透明质酸，增加脑ECS体积，并已被证明可以改变啮齿动物的神经生理学特性。结果显示，透明质酸酶处理组的小鼠相比对照组表现出更多社交回避行为，这进一步支持了NAc ECS的变化与社交行为变化相关的结论。

Fig3. 应激引起的 MMP8 增加与 NAc 中的 ECS 改变有关

    研究者进一步评估验证了MMP8是否与压力引起的社交回避之间存在因果关系。对小鼠进行腹膜内注射rMMP8结合亚阈值社会挫败应激（剂量设置为使其在血浆中的水平与SUS小鼠在CSDS后观察到的 MMP8水平相似），观察是否会促进应激易感性。结果显示，与未应激小鼠相比，rMMP8与亚阈值应激结合会导致社交互动比值SI降低。随后，研究者检测了rMMP8是否会改变社会偏好。这里他们使用了社会条件位置偏好 (sCPP) 测试。sCPP是条件位置偏好（conditioned place preference, CPP）的一种变体，用于评估社交是否有奖励/吸引力。通过把社交刺激（通常是一只无威胁的幼年同种异体或同种同性小鼠）与特定的实验舱室配对，之后在无刺激的测试中看动物是否偏好那个曾与“社交”配对的舱室。若偏好增加，说明该社交体验具有奖励性质；若偏好被抑制，说明社交奖励减少（可能对应社交功能受损或快感缺失）。在此测试中，三天亚阈值社会挫败应激小鼠与对照组小鼠会对之前与幼鼠配对的舱室产生偏好，而接受rMMP8的小鼠这种社会偏好减弱。

    为了选择性地消耗外周白细胞中的Mmp8并防止Mmp8种系缺失的非特异性发育效应，研究者通过骨髓移植（BMT）构建了嵌合小鼠。使用来自Mmp8^-/-或Mmp8^+/+（野生型）供体小鼠的造血干细胞，创建了外周白细胞中特异性缺乏Mmp8的嵌合小鼠（Mmp8^-/-→ WT）或野生型对照（WT → WT）（箭头前面是供体，后面是受体，对照组经历了同样的放疗、骨髓移植、恢复期以排除手术影响）。随后这些小鼠经历CSDS，并对NAc和PFC中的ECS进行行为测试和评估。

Mmp8^-/-→ WT小鼠血液中的MMP8完全缺失，这验证了BMT的效率并证实了MMP8的来源确实是外周白细胞。结果还显示，野生型和敲除BMT小鼠之间存在高度嵌合性 (85–90%)，并且外周单核细胞、中性粒细胞、细胞因子或趋化因子的频率没有差异，这表明外周MMP8的消耗不会导致外周免疫系统发生重大变化。行为上，与WT → WT小鼠相比，移植了Mmp8^-/-小鼠造血干细胞的小鼠在CSDS后对CD-1 小鼠的社交回避较少。在测试小鼠与同性幼鼠的社交互动时也观察到了类似的效果。 研究人员并没有观察到MMP8缺失对其他非社会压力相关行为（如蔗糖偏好测试、溅水测试或高架十字迷宫）产生影响。同样也未发现对疾病相关行为（体重、食物摄入量或一般运动能力）有任何影响。

    此外，在未应激状态下，Mmp8全身性构建敲除（constitutive knockout, cKO）小鼠在运动能力、社会互动、或外周白细胞亚群频率等方面与年龄匹配的野生型同窝鼠没有差异。但与Mmp8^-/-骨髓嵌合鼠的数据一致，这些cKO小鼠在CSDS后的SI更高，表明它们的社交回避更少。综上，MMP8会增加小鼠社交应激易感性。

Fig4. 循环MMP8与压力引起的社交回避行为、大脑ECS和神经生理学的改变有因果关系

    研究者进一步评估了MMP8 是否与ECS和NAc神经生理学的变化有关。再次使用透射电子显微镜评估了应激小鼠NAc和PFC中的ECS体积。我们发现，与 WT → WT 小鼠相比，Mmp8^-/-→ WT 小鼠的NAc中的ECS减少，但PFC没有变化。鉴于既往研究已经表明，大脑ECS的变化以及MMP介导的细胞外基质（ECM）重塑与神经元生理改变有关，如果ECS变窄，神经递质更容易在局部累积，导致突触兴奋性增强；如果ECS变宽，信号扩散更快，局部浓度降低，可能减弱突触传递。因此研究者对cKO和野生型小鼠NAc中的主要神经元——中等棘神经元 (MSN) 进行了离体全细胞膜片钳记录。MSN主要是抑制性神经元（释放 GABA），接收来自前额叶皮层、海马、杏仁核等部位的兴奋性谷氨酸输入，以及黑质/腹侧被盖区的多巴胺输入。先前的研究表明，CSDS会导致 SUS小鼠的NAc中的MSN发生神经生理学变化，包括内在神经元兴奋性增加和兴奋性突触后电流 (EPSC) 频率增加。Mmp8^-/-缓解了应激诱导的神经元兴奋性升高以及自发性EPSCs的增加，但并未影响静息膜电位、阈电流（rheobase）或自发性EPSCs的振幅。说明细胞的基础状态和离子通道没被改变，且基本兴奋阈没变，变化主要在突触输入频率或放电模式。

    至此，研究者证明了应激引起的外周MMP8升高，会导致NAc ECS 的改变，并与NAc神经生理以及社交回避相关。

03 结束语

    虽然已有多项研究证明了外周免疫因子（如细胞因子或不同类型的免疫细胞）与行为改变之间存在因果关系，并证明或推测其机制是直接作用于神经元（例如，细胞因子与神经元受体结合），但这篇研究展示了一种不同的途径：应激促进外周免疫细胞与大脑的相互作用，通过来自外周循环的免疫细胞分泌的MMPs（如 MMP8）改变ECS，从而影响神经元功能和社会行为。这些数据为神经免疫机制在神经精神疾病中的新兴作用提供了重要见解，突出了生物标志物和治疗方案的新的外周靶标。

    未来的研究需要更精确地操纵大脑不同区域ECS 的组成部分，将其与特定的行为和神经生理变化相联系，并寻找更多影响ECS稳态的外周和中枢因素。此外，还需回答一个问题：区域特异性的单核细胞如何实现在特定区域精准释放蛋白酶（如把MMP8 局部释放到像NAc这样的地方），从而改变那里神经元的状态。

04 知识拓展

    表型分析就是根据细胞表面和内部的标志物（蛋白、功能状态等）来给细胞分类。高维表型分析是指一次性检测几十种甚至上百种标志物，并结合计算方法解析细胞亚群和功能状态。可以实现在一个样本里全面“描绘”免疫细胞的多维身份，区分罕见亚群，看免疫谱的动态变化。

    高维表型分析常用技术包括：1. 质谱流式细胞术（CyTOF, cytometry by time-of-flight mass spectrometry）；2.高参数荧光流式细胞术（>20色）；3. 单细胞多组学（scRNA-seq, CITE-seq）；4. 成像质谱流式（imaging mass cytometry）；5.多重免疫荧光染色（multiplex immunofluorescence）。

05 Take-home messages 

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