微精选

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01 

背景知识

镜像神经元（mirror neurons）是存在于人类和动物大脑中的一种特殊类型的神经元，最初在猴子的研究中被发现，这些神经元不仅仅在猴子执行某个动作时激活，在猴子观察到其他个体执行相同动作时也会被同等的激活，因此，从发现之初，镜像神经元就被认为与学习、模仿、共情等高级认知功能有关。下丘脑腹内侧核（Ventromedial hypothalamus，VMH）自20世纪早期被鉴定以来一直被不断研究，过往研究表明，实验性激活不同物种位于尾内侧下丘脑的攻击中心会引起对同种动物、其它物种甚至是无生命物体的攻击，因此该区域往往被称作攻击中心（attack center）。小鼠的攻击中心被确定为下丘脑腹内侧核腹外侧区（Ventrolateral sector of the VMH，VMHvl），该区域神经元，称作VMHvl^PR神经元，同时表达雌激素受体α（ERα or Esr1），其靶向消融和急性化学遗传抑制，能够减少雄性的领土攻击。相反，强制性激活VMHvl^PR神经元会引发攻击性。最近的研究表明，VMHvl^PR神经元以社会环境敏感（Social context-sensitive）的方式引起攻击行为。在本文中，研究人员通过攻击镜像-TRAP（aggression mirror-TRAP）策略，在高度保守的脊椎动物大脑区域发现了一个非皮层的镜像神经元系统–mirro-TRAP VMHvl^PR神经元，它在功能上代表了生存所必需的攻击行为。mirro-TRAP VMHvl^PR神经元对于攻击性是必要且充分的，VMH不仅仅作为攻击中心，更是介导了对于攻击行为的感知，这种感知不仅在适当环境中引起战斗，也能在观察第三方的攻击性互动时触发。总之，本研究中，实验人员想要解决两个问题：1）VMHvl^PR神经元如何与攻击行为相关联；2）VMHvl^PR神经元在攻击行为中发挥着怎样的作用。

02 

重要研究结果

为了检测VMHvl^PR神经元是否对攻击行为敏感，研究人员首先在进行攻击行为的小鼠中确定了VMHvl^PR神经元的反应性，以便后续能够与这些细胞在小鼠目睹攻击行为时可能出现的反应进行比较。研究人员构建了领地者-入侵者的研究模式：单笼饲养的雄性小鼠，当有一只雄性入侵者被放入笼子之后，采用光纤光度法（fiber photometry）表征VMHvl^PR神经元的激活情况（图1B）。结果显示，领地者小鼠展现了对入侵者小鼠的领地攻击性（Territorial aggression），并在领地者小鼠进行化学探索（包括肛门生殖器部位和身体其他部位）、理毛、进行身体攻击如咬或扭打以及尾部颤动（被认为是一种对对手威胁信号）这些行为时，观察到了VMHvl^PR神经元显著且特异的神经元活动上升（图1C,D,I-K），证实VMHvl^PR神经元在领地者小鼠的两种不同形式攻击行为中均被激活：咬或扭打等直接进攻行为和尾部颤抖的威胁行为。

为了进一步研究小鼠在观察其他小鼠攻击行为时VMHvl^PR神经元的反应性，研究人员设计了一个实验装置，该装置使得研究人员能够记录到单笼饲养的观察者小鼠VMHvl^PR神经元的活动情况（图1E,F）。通过这个装置，研究人员发现，观察者脑中的VMHvl^PR神经元在其目击攻击行为和尾部颤动时均会激活。不同的是，在攻击行为发生时，施暴者的VMHvl^PR神经元的活动增加幅度比观察者的VMHvl^PR神经元要大（图1E,F）；而在尾部颤动行为发生时，施暴者和观察者的VMHvl^PR神经元的活动增加幅度则是相当的（图1G,H）。值得注意的是，观察者的VMHvl^PR神经元仅在观察到攻击相关行为时激活，而在其它社交行为如化学嗅探、理毛等行为中保持沉默（图1I-N），证实VMHvl^PR神经元在小鼠自身参与打斗以及目睹其他小鼠打斗时处于活跃状态，而不会在其它社交行为中激活。证实VMHvl^PR神经元的反应具有特异性，它们主要对攻击和尾巴颤动的行为有反应，对其他行为如嗅探没有反应。此外，研究人员还评估了攻击中心的调节性别识别和攻击性的神经元群体–表达激素肽1的终纹床核神经元（tachykinin 1-expressing BNST，BNST^Tac1）是否具有镜像特性，发现BNST^Tac1神经元在参与攻击行为时均被激活（图S1J-K）；但不直接参与战斗的观察者小鼠脑中的BNST^Tac1神经元则未被激活（图S1L）。以上结果表明，VMHvl^PR神经元具有与攻击行为相关的镜像特性，即观察和参与攻击行为时，VMHvl^PR神经元激活，而观察非攻击行为时，VMHvl^PR神经元不激活，这种镜像特性并不是所有能够调节攻击行为的神经元群体所共有的。

图 1 VMHvl^PR神经元在自我和他人的攻击过程均活跃

感觉输入和社会经验调节雄性小鼠的领地攻击行为，研究人员想进一步确定引起攻击镜像特性的天然感知线索是什么。本实验的实验装置允许观察者小鼠透过穿孔的透明隔板获得来自示范者小鼠的视觉和化学信号线索，研究人员分别检测了这两种信号以确定其在攻击行为中的作用。

主嗅觉上皮（main olfactory epithelium，MOE）是嗅觉系统的重要组成部分，与犁鼻器（VNO）一起，参与感知雄性信息素等化学信号，对于引起攻击行为至关重要。实验装置中间的孔洞允许观察者小鼠能够接触到来自示范者小鼠的易挥发的化学信息素，这些信息素能被观察者脑中的VNO和MOE神经元感受到。研究人员用实心透明隔板代替穿孔隔板，并在示范鼠上方安装了实心透明天花板，从而减少示范鼠信息素对观察鼠的影响。结果显示，实心隔板中观察者的VMHvl^PR神经元的激活水平与穿孔隔板的情况相似（图S2F-I）。尽管不能完全排除观察者在本实验中感知信息素的可能性，但研究结果表明，信息素感应对于 VMHvl^PR 神经元的攻击镜像可能不是必需的。接下来，便要确定攻击镜像是否需要视觉输入。 研究人员使用了带穿孔隔板的装置，但采用小鼠不敏感的红外光谱（850 nm，≤1 lux）作为光照（图2D），发现观察者VMHvlPR神经元对物理攻击或尾巴颤动没有明显的激活（图2E,F），而在攻击者中，这些细胞被激活了（图S2J-L），证实观察者中神经元不激活并非缺乏功能性GCaMP6表达引起的，而是缺乏视觉信息导致镜像特性消失。同理，如果视觉线索在攻击镜像中起关键作用，那么当观察者背对着示威者时，VMHvl^PR 神经元亦不会被激活。因此，研究人员评估了常规照明下观察者小鼠背对进行攻击示范小鼠时的VMHvl^PR 神经元激活情况，结果与前一致（图S2M-N）。因此，视觉输入在 VMHvl^PR 神经元的攻击镜像中起着关键作用，而化学信息素可能不是 VMHvl^PR 神经元的攻击镜像所必需的。

如前所述，社会经验亦会调节动物的领地攻击行为，以上实验证实，VMHvl^PR神经元是具有攻击镜像特性的神经元，以前关于镜像神经元的研究多是在动物学习某种运动技能的情境下发生的，而攻击行为和性行为均被认为是一种无须提前学习的先天行为，且在本研究中，小鼠在纳入实验之前就已经出现过攻击行为，所以本研究尚无法确定VMHvl^PR神经元是先天存在的，还是在社会经验之后才出现的。因此，为了确定在先天行为中，镜像神经元是否会发挥作用，研究人员对未经历过性行为和领土攻击行为的社会经验幼稚的观察者小鼠的VMHvl^PR神经元进行了成像，发现幼稚观察者神经元的反应与具有社会经验的男性的观察者神经元的反应相似（图2G-I），说明即使没有经历过攻击性试验，这些神经元仍然能够表现出与攻击行为相关的镜像功能。不同的是，有经验的小鼠中 VMHvl^PR 神经元的镜像反应在实际战斗开始之前就已出现，而社会经验缺乏的小鼠的镜像反应出现在攻击开始时（图1E-F,2H-I），表明战斗经历调节了神经元的镜像活动。综上，视觉输入，而不是先前的经验，对于 VMHvl^PR 细胞的攻击镜像至关重要。

图 2 视觉输入是VMHvl^PR神经元镜像的必要条件

从理论上讲，这些VMHvl^PR神经元在攻击者和观察者中被激活的情况有三种可能：完全相同的神经元集合被激活、部分神经元集合重叠被激活、完全不同的神经元集合被激活，前文所用的纤维光度法提供了神经元群体整体活动的情况，无法区分相同、不同或重叠的细胞亚群是否在攻击者和观察者中被激活（图3A）。为了进一步确定单个 VMHvl^PR 神经元在参与和观察攻击行为期间是否活跃，研究人员采用微型显微成像（miniscope imaging）分析了GCaMP6s标记的单个VMHvl^PR 神经元在实验期间的激活情况（图3B-L），通过采用严格的降噪和分割处理流程，在攻击者和观察者中分别鉴定出152个和88个具有可靠GCaMP6s荧光的神经元。接着，研究人员分别研究了这些细胞在攻击行为期间的激活情况，发现61-78%的 VMHvl^PR 神经元在观察者和攻击者中单个神经元激活峰值相当（图3D-L，S3A-D）；16-34%的 VMHvl^PR 神经元受到抑制，5-11% VMHvl^PR 神经元没有明显变化（图S3A-M），与之前的工作发现一些 VMHvl 神经元在攻击者中受到抑制或静止结果一致。接着，研究人员确定了 69 个 VMHvl^PR 重叠激活的神经元，这些神经元在攻击者和观察者执行或观察物理攻击期间均被激活（图S4A），且峰值和净激活率相当（图4A-D），在尾部颤动时也能观察到类似结果（图4E-H）。因此，单个 VMHvl^PR 神经元在执行和观察攻击或尾部颤动期间被共同激活，证实了单个的攻击镜像神经元的存在。

目前，镜像神经元的激活在灵长类动物中大致呈现两种类型，一类是严格一致的镜像神经元，它们在观察和执行行为时，激活代表完全相同的运动；另一类是大致一致的镜像神经元，它们在观察和执行行为时，激活代表指向相同目标但不完全相同的运动。尽管已经证明了单个 VMHvl^PR 神经元能够在攻击者和观察者中被同时激活，但是，这些具有攻击镜像特性的VMHvl^PR 神经元对前文描述的两种攻击行为是严格一致的激活还是大致的激活还无法确定。基于此，通过比较单个神经元在进攻和尾部颤动两种行为期间的激活情况，研究者发现，攻击者或观察者的单个神经元在进攻行为和尾部颤动期间均被激活，且二者具有相似的动力学、单个细胞的峰值激活和群体净激活（图S4C-J），研究 人员进一步测试了单个神经元是否可以代表攻击行为和观察尾部摇晃行为。在执行和观察攻击行为和尾部摇晃行为时，分别激活了重叠的VMHvl^PR细胞集合（图4I–P,S1），以上结果表明VMHvl^PR神经元可以表征不同的攻击性运动行为，从这个意义上说，它们显示出大致一致的镜像特性。

图 3 单个VMHvl^PR神经元参与和观察攻击时共同激活

图 4 单个 VMHvl^PR 神经元在参与和观察攻击期间均激活

为了进一步探究观察者的VMHvl^PR神经元在领地攻击行为中的功能相关性，研究人员采用TRAP2技术可以给那些因进行攻击行为而Fos被激活的VMHvl神经元打上tdTomato荧光蛋白的标记（如图5B左图所示）。随后，让这些雄性小鼠去观看正在打斗的攻击者小鼠，并采用免疫标记的方法来检测被激活的神经元中的Fos蛋白（如图5B右图），发现大多数攻击性标记的（tdTomato+）VMHvl 神经元在观察攻击行为时表达 Fos（图5C）。然而，并不是所有被标记为tdTomato+的细胞都表达Fos，可能是因为tdTomato标记的是在之前攻击行为中被激活的神经元，而Fos是在观察攻击行为时被诱导表达的，两者并不完全重合（图5B,C），这与微型显微镜的结果一致。为了研究这些TRAP处理后的神经元的活动情况，研究者在观察者 VMHvl 神经元中表达 GCaMP6s，并检测了这种策略是否会产生足够的GCaMP6s用以在执行和观察攻击期间进行纤维光度测量（图5D），结果显示当小鼠进行攻击行为和观察攻击行为时，经过TRAP策略处理的小鼠神经元均被激活（图5E-F,S5B-E），表明 TRAP2 标记的 VMHvl 和 VMHvl^PR 镜像神经元之间存在密切的对应关系。

图5 攻击镜像-TRAP策略捕获观察者VMHvl^PR神经元

为了进一步研究在执行和观察攻击行为期间均激活的神经元与攻击行为的功能相关性，研究人员将抑制性化学遗传元件DREADDi注射到 VMHvl，并注射4OHT捕获攻击行为中激活的神经元，实现DREADDi的特异表达（图6A,S6B），研究者测试了接受CNO或vehicle的原住民小鼠的攻击行为差异。在这种实验模式下，接受CNO给药的小鼠发起攻击行为的可能性降低了3倍（图6C-D），攻击时间减少超过10倍（图6E-G），但CNO 给药没有减少嗅探或其他非攻击性社交互动（图S6A），证实抑制 VMHvl神经元后，小鼠攻击性减弱，但社交互动行为并未减少。研究者还测试了抑制攻击镜像-TRAP VMHvl 神经元是否会抑制交配行为，以此评估VMHvl 神经元的特异性。结果显示，CNO给药的领地者小鼠无论是启动交配程序的可能性还是性行为模式方面，均显示出和对照组小鼠相当的交配行为。以上结果证实，攻击镜像 VMHvl 神经元在雄性领土攻击的显示中起着特定和重要的作用。

图 6 攻击性镜像VMHvl神经元对领地攻击至关重要

图 7 攻击性镜像VMHvl神经元足以诱发攻击性行为

03

结语

本研究采用了多种神经科学方法鉴定了攻击性的镜像神经元的存在，其论证过程之严谨，实验方法之精妙，值得细细品读。在不同环境下记录神经元的功能以及进行功能询问对于理解这些神经元如何促进行为是至关重要的，这有助于了解在自我观察和执行动作时，单个神经元如何共同表征更高的认知功能。本研究回答了关于镜像神经元对于持续性行为的贡献这个长期的问题。本研究重要结论如下：

1. 单独的VMHvl^PR神经元在攻击行为或目击攻击行为期间都是协同活动的

2. VMHvl^PR神经元的活动反映了其他个体之间的攻击性

3. 攻击性镜像神经元对于自我的领土攻击至关重要

4. 攻击性镜像神经元可以诱发对雄性、雌性和镜子的攻击性

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