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01 研究背景

    从细菌到人类的各类生物体均需要铜离子作为酶的辅因子发挥生物学功能。细胞内铜离子被维持在极低水平，防止游离铜离子的大量累积而导致细胞死亡。尽管其他金属离子（如铁离子）所导致的细胞死亡的具体机制已被阐明，铜离子诱导的细胞死亡的机制尚未可知。

    铜离子载体是结合铜离子、将铜离子转运至胞内的小分子物质。已有研究证据表明，铜离子载体导致细胞死亡是由于胞内铜离子的累积，而非载体本身。此外，铜离子载体可诱导数百个细胞系的死亡，这可能提示这种死亡所涉及的分子机制可能是在进化上高度保守的。这篇文章从铜离子载体入手，深入考察了铜死亡的机制。

02 主要研究结果

    研究人员首先考察了铜离子载体诱导的细胞死亡是否是由于铜的累积。铜主要来源于血清，当把细胞培养在无血清培养基中时，铜离子载体elesclomol诱导的细胞死亡被显著抑制，而人为添加铜后恢复了elesclomol的作用。此外，外源性补充铜，使得细胞对铜离子载体的敏感性提高。采用TTM螯合铜后显著抑制了elesclomol诱导的细胞死亡，而其他金属离子的螯合剂没有这种效果。多种铜离子螯合剂都会导致胞内铜离子浓度升高5-10倍。上述结果共同表明，铜离子载体诱导的细胞死亡是由于胞内铜的累积。

    进一步，研究人员提出问题：铜离子载体诱导的细胞死亡是否被严密调控？短时的铜离子载体对细胞的处理是否导致不可逆的细胞死亡进程？研究结果表明，仅用40 nM的铜离子载体处理细胞两个小时就能导致胞内铜离子升高15-60倍，且细胞死亡持续到24小时后。这表明，铜离子载体诱导的细胞死亡是被严密调控的。

    那么，铜离子载体诱导的细胞死亡涉及哪些具体的分子信号通路呢？研究人员发现，elesclomol不会导致caspase3/7的激活，并且敲除Bak/Bax不会影响elesclomol诱导的细胞死亡；多种凋亡、坏死性凋亡和铁死亡的抑制剂均不能有效缓解elesclomol诱导的细胞死亡。上述结果说明，铜离子载体诱导的细胞死亡是一种全新的细胞死亡方式。

Fig1. 铜离子载体诱导的细胞死亡既不是凋亡、也不是铁死亡或坏死性凋亡

    进一步，研究人员深入考察了铜离子载体诱导的细胞死亡所涉及的分子机制。研究人员发现，依赖于线粒体呼吸的细胞对铜离子载体的敏感度是发生糖酵解细胞的将近1000倍。电子传递链复合体I和II的抑制剂以及线粒体丙酮酸载体的抑制剂显著缓解了铜离子载体诱导的细胞死亡，而线粒体解偶联剂FCCP没有效果，表明线粒体呼吸、而不是ATP的合成，参与了铜离子载体诱导的细胞死亡。有趣的是，铜离子载体并没有导致基础呼吸或ATP相关的呼吸出现显著降低，但却显著降低了呼吸的备用产能。此外，elesclomol以时间依赖的方式导致TCA循环相关代谢产物的失调。上述结果提示铜离子载体并非直接靶向ETC，而是靶向TCA循环中的分子。

Fig2. 线粒体呼吸调控铜离子载体诱导的细胞死亡

为了找到介导铜离子载体诱导的细胞死亡的代谢通路，研究人员采用全基因组CRISPR-Cas9 loss-of-function筛选，分别鉴定出两种结构不同的铜离子载体Cu-DDC和elesclomol-Cu诱导的细胞死亡所依赖的分子，并将两个结果取交集，最终筛选出FDX1（编码一种还原酶，将二价铜离子还原为更具毒性的一价铜离子）、6个编码硫辛酸通路分子的基因（LIPT1、LIAS、DLD）和硫辛酰化修饰的蛋白（丙酮酸脱氢酶复合体，包括DLAT、PDHA1、PDHB）。对3000种代谢酶的独立敲除实验结果也验证了上述发现。

独立的基因敲除实验进一步明确了敲除FDX1或LIAS导致了细胞对elesclomol等多种铜离子载体产生耐受，而对caspase激活剂、凋亡诱导剂或铁死亡诱导剂没有产生耐受。上述实验结果共同阐明，铜离子诱导的细胞死亡依赖于FDX1和硫辛酰化蛋白。

Fig3. FDX1和硫辛酸基因是铜离子诱导的细胞死亡的重要中介分子

    蛋白硫辛酰化修饰是一种高度保守的亮氨酸转录后修饰，只发生于4种酶。而这4种酶均涉及调节碳原子进入TCA循环的代谢复合物，包括二氢硫辛酰胺支链转酰基酶 E2（DBT）、甘氨酸剪切系统蛋白H（GCSH）、二氢硫辛酰胺 S-琥珀酰转移酶（DLST）和二氢硫辛酰胺转移酶（DLAT）。这些蛋白需要硫辛酰化修饰来获得酶的功能。

    如前所述，研究人员已经发现敲除FDX1或硫辛酰化修饰相关酶会导致细胞对铜离子载体产生耐受，那么FDX1和硫辛酰化修饰是否存在上下游关系呢？首先，研究人员对Cancer Dependency Map网站进行挖掘，发现FDX1与硫辛酸相关通路在影响细胞存活上具有显著相关性。其次，对208种人肿瘤标本进行FDX1和硫辛酰化修饰蛋白的免疫组化染色，研究人员发现，FDX1和硫辛酰化修饰蛋白的染色呈显著正相关。第三，WB和免疫组化结果表明，敲除FDX1取消了蛋白的硫辛酰化修饰。第四，代谢产物分析结果表明，敲除FDX1导致了丙酮酸盐和α-酮戊二酸的堆积以及琥珀酸的显著降低，这与抑制硫辛酰化修饰时的状况一致。最后，敲除FDX1导致LIAS的核心底物SAM的大量堆积。这些实验结果共同证明了FDX1是蛋白硫辛酰化修饰的上游调控分子。

Fig4. FDX1是蛋白硫辛酰化修饰的上游调控分子

    上述实验结果证明了铜离子导致的细胞毒性与蛋白硫辛酰化修饰有关，但尚没有说明其中的具体作用机制。已有报道表明，铜能直接结合游离的硫辛酸，并且解离常数为10^-17，研究人员猜想铜可能直接结合硫辛酰化修饰的蛋白。为了验证这一猜想，研究人员纯化了DLAT和DLST，发现这些蛋白可与树脂固定的铜所结合，而不能与钴或镍结合。利用敲除FDX1来抑制蛋白硫辛酰化后，DLAT和DLST不再结合铜离子，因此硫辛酰化修饰的部分是铜离子的结合位点。

    进一步，非还原凝胶电泳结果表明，铜离子与硫辛酰化修饰的TCA循环相关分子结合后，导致了DLAT的低聚化；敲除FDX1后降低了细胞对elesclomol刺激下DLAT的低聚化的敏感性，即需要更高浓度的elesclomol才能使DLAT发生低聚化；免疫荧光的结果也支持上述发现。质谱分析结果表明，铜离子载体以FDX1依赖的方式导致了铁硫簇蛋白的丢失。上述结果表明，铜离子载体导致硫辛酰化修饰蛋白的低聚化，从而导致蛋白功能的异常增强。

Fig5. 铜直接结合和促进硫辛酰化修饰DLAT的低聚化

Fig6. 化学性诱导的铜离子依赖性细胞死亡与遗传学诱导的铜离子依赖性细胞死亡具有相似的机制

03 重要研究结论

    该研究利用严密的实验设计和逐步论证，发现铜离子通过直接结合TCA循环中的硫辛酰化修饰的蛋白，导致硫辛酰化蛋白的低聚化、铁硫簇蛋白的丢失和HSP70的上调，最终诱导细胞死亡。这篇文章鉴定了铜离子诱导的独特的细胞死亡机制，并将这一过程命名为“铜死亡（cuproptosis）”。

    铜死亡机制的阐明为治疗Menke’s病和Wilson’s病等铜稳态失衡疾病提供了可能的研发靶点，也为未来利用铜死亡机制来杀伤肿瘤细胞奠定了理论基础。

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