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【导读】

溶酶体作为细胞的“消化车间”，其内部常年保持着pH4.5-5.0的酸性环境，这种酸性平衡依赖于V-ATPase介导的质子流入及未知“质子泄露”途径的协同。长期以来，“质子泄露”的分子机制并不明确，而帕金森病的风险蛋白TMEM175虽被认为与溶酶体功能相关，但其具体作用存在争议。这篇文章围绕“TMEM175是否为溶酶体中关键的质子泄露通道”这一核心问题展开研究。

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01 研究背景

溶酶体作为细胞内的 “消化器官”，其酸性微环境（pH 4.5-5.0）是维持水解酶活性、保障蛋白降解功能的核心条件，溶酶体通过V-ATP酶建立50-5000倍的跨膜氢离子浓度梯度来驱动离子和代谢物跨膜主动转运。溶酶体pH异常会损害溶酶体的各种功能，包括物质降解、分解代谢物输出、囊泡运动和营养感应调节等，导致毒性物质异常聚集，从而影响阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）等神经退行性疾病和溶酶体贮积病（LSDs）的发生。

单个溶酶体的pH“稳态”由氢离子跨溶酶体膜的流入和流出动态平衡决定。抑制介导氢离子流入的V-ATP酶会很快出现溶酶体内环境碱化，这表明在溶酶体膜上还存在未知的通道介导氢离子流出，但既往氢离子流出的具体机制仍不清楚。

本篇文章的灵感来源于团队早期的一个发现：在对细胞内溶酶体膜直接进行电生理记录时，只要溶酶体膜内外仿照生理条件存在pH差别，即膜外为pH=7.2的中性环境，膜内为pH=4.6的酸性环境，就总能记录到特异性从膜内流向膜外的微弱电流。将膜内pH调整为更加酸性的3.5时，这个信号更加强烈。基于这一观测，作者大胆猜想这一电流的来源可能是溶酶体膜上的氢离子通道，与V-ATPase相互配合，共同调节溶酶体pH。

该研究报道了一种普遍表达的溶酶体膜蛋白——TMEM175，当其腔内侧暴露于酸性pH环境时，便具有了高度选择性的氢离子渗透功能。TMEM175介导氢离子流出来平衡V-ATP酶介导的氢离子流入，从而维持溶酶体pH稳态。TMEM175既往曾被报道为溶酶体中的钾离子流出通道，但这一结论是在腔内侧pH高于7.0的情况下得出的。而在溶酶体生理状态（pH4.5-5.0）时，该研究发现TMEM175对氢离子的渗透性大约是钾离子或钠离子的105倍。且通过TMEM175的离子流中大于90%是由氢离子激活TMEM175后介导发生的。此外，TMEM175还可以被内源性脂质、小分子化合物DCPIB（容积调控氯离子通道抑制剂）和ML67-33（K2P通道激活剂）激活。在溶酶体的生理条件下，TMEM175不是自然开放的钾离子通道，而是氢离子或脂质门控的氢离子通道。

02 重要研究结果

作者构建了一个Whole-LEL模型，以观察不同pH下，溶酶体H+流向。在取出晚期内体和溶酶体（LEL）后，用vacuolin-1（溶酶体胞吐抑制剂）处理，限制其内部物质的向外转运，从而扩大体积，便于后续观察及操作。Pipette吸住LEL后破膜，使其内部电生理液与LEL内液贯通，外接电路的正极连接细胞质一侧，负极连接Pipette一侧，H+流出LEL会导致电子的反向移动，因此，可以用电流方向与强度表示H+的方向与强度。

当管腔内pH（pHL）为4.6，胞浆pH（pHC）为7.2时，检测到微弱的电流。进一步下降pHL至3.5，检测到强烈的电流。作者将这种H+依赖的外向电流通道称为溶酶体质子激活质子通道（LyPAP）。这是一种存在于多种细胞中的溶酶体质子通道，其活性在pHL为4.6时开始被检测到，这是溶酶体最佳pH范围的下限，随着pHL进一步下降，其活性显著增加。

为了拨开LyPAP的“庐山真面目”，作者在pHL为4.6的COS1细胞中进行表达筛选，该文库包含基于蛋白质组学研究确定的一系列假定的通道/转运蛋白样溶酶体膜蛋白，只有仅过表达TMEM175的细胞LyPAP电流比对照组细胞、转染其他候选蛋白的细胞或转染已知具有质子通透性的溶酶体通道的细胞大20倍以上。为了进一步验证TMEM15是否是LyPAP的分子真身，作者在敲除TMEM175的HAP1、HeLa和HEK293T细胞中将pHL设置为3.5，也未观察到LyPAP电流，而在WT细胞或是重新表达TMEM175的细胞中可以观察到LyPAP电流。因此研究人员认为TMEM175是溶酶体LyPAP电流必需的。由于没有合适的抗体用于免疫检测内源性TMEM175，作者使用血凝素（HA）标记的TMEM175敲入HAP1细胞，在这些细胞中观察到大多数HA阳性标记与LAMP1重叠，由此明确了TMEM175在细胞内定位于溶酶体。

Fig1. TMEM175是溶酶体质子激活质子通道（LyPAP）的必要且充分条件

为了排除其他溶酶体组分的干扰，将TMEM175异位表达于HEK293T细胞的质膜，发现在TMEM175转染的HEK193T细胞中，酸性细胞外pH（pHE/L）可以诱发强烈的全细胞电流（I_TMEM175），这在Sham组细胞中从未观察到。进一步使用全细胞记录I_TMEM175的pH依赖性，当pHC为7.2，NMDG+是记录溶液中唯一的阳离子（阻断Na+/K+电流），全细胞I_TMEM175在-120mV时随着pHE/L的降低，电流幅值增加。

以往研究认为TMEM175是溶酶体钾离子通道。当pHC设为5.0，改变pHE/L，测量电流反转电位（Erev）作为氢离子梯度的函数（ΔpH=pHE/L-pHC）。当NMDG+、Na+或K+为主要阳离子时，Erev随ΔpH 变化斜率为-53mV/ΔpH，接近理论质子通道能斯特斜率（-58 mV/ΔpH, 25°C），证明TMEM175具有高度质子选择性。并且即使胞内K+高达140mM（生理浓度）时，Erev仍由质子梯度主导，这推翻了以往钾通道假说。

通过pH成像对质子流进行功能验证，作者使用基因编码的pHluorin和pHi化学荧光指示剂（pHrodo TMred）证实，质子通过TMEM175大量内流。由此通过跨膜pH梯度精确操控、离子选择性置换，结合电生理与动态成像，多维度证实：TMEM175是溶酶体特异的LyPAP。

Fig2. TMEM175是高度质子选择性的通道

在确定其功能之后，作者又对TMEM175的活性调控进行研究。花生四烯酸（ArA）作为一种内源性多不饱和脂肪酸，已有报道可以增加溶酶体对K+和H+的通透性。为了验证TMEM175是否是ArA的分子靶点，作者在pHL为4.6时应用ArA，发现显著增加了COS1细胞LEL氢离子电流及过表达TMEM175的HEK293T细胞的全细胞氢离子电流，这提示细胞内脂质信号可能动态调节TMEM175的活性，进而精细调控溶酶体pH。紧接着，作者进一步测试了合成工具化合物对TMEM175是否有调节作用。作者发现DCPIB和ML67-33可以强效激活TMEM175，这为研究TMEM175激活的生理后果和信号通路提供强大的药理学工具。

以往研究中，在非生理条件的中性pH下，TMEM175被描述为组成性开放的K+渗漏通道。作者在生理性酸性pH下发现其基础H+电流相对小且仅在部分溶酶体中可以检测到。而ArA、DCPIB和ML67-33能强烈激活TMEM175，这种激活幅度可以达到基础水平的100倍以上结果强有力地证明了，在生理条件下，TMEM175主要是受门控调控的通道，而非持续开放的渗漏通道。

但是不管是ArA还是DCPIB都不能作为溶酶体日常调控的信号，作者进一步探究TMEM175调控的机制，溶酶体的核心生理特征是管腔内酸性环境，这才可能是天然的激活信号，因此，必须确定TMEM175是否是pHL依赖性激活（门控）。于是，作者将pHC设为4.6，pHE/L设为7.2，以建立与溶酶体正常情况下方向相反的氢离子梯度，发现在pHE/L设为7.2时无明显电流生成，而pHE/L为4.6时引发了强烈电流。这个发现证明，TMEM175的激活信号来源于管腔的H+，而不是胞质侧的H+或跨膜H+梯度本身的方向。

Fig3. 花生四烯酸与合成化合物激活TMEM175

虽然前文中作者已证明TMEM175具有高度质子选择性，但仍存在疑问：TMEM175在非生理条件下可微弱传导K+，这种传导是否具有生理意义？并且TMEM175 KO同时移除了H+、K+通透性，究竟是哪个离子流的缺失导致了表型？作者需要更直接的分子证据证明H⁺通透性是其核心生理功能。若是可以构建“仅失去H+传导而保留K+传导”的突变体，即可通过与WT对比功能差异，验证质子传导的必要性。

于是作者基于TMEM175的已知结构，推测孔区带负电荷的氨基酸（Asp、Glu、His）可能参与H+感知或通透，系统性突变这些候选残基，筛选可以特异性消除H+电流而保留K+电流的突变体，最后筛选出D41A突变完美满足要求：失去H+电流，保留DCPIB激活的K+电流，且K+电流仍受酸性pH抑制。作者对D41A的定位及H+流进行验证，确认D41A突变体可以正确靶向溶酶体，排除定位错误导致功能丧失的可能。使用pH成像在活细胞水平证实D41A突变无法介导H+内流，强化了全细胞记录的结论。

同时，作者也找到了其他TMEM175的变异体，其中S45A突变部分丧失K+通透性但H+正常。作者在后文中将D41A突变体和S45A突变体对溶酶体pH的影响进行对比，探究H+传导对TMEM175的影响。

P.M393T是基因组相关联研究发现的PD风险变异体，通过对其进行进一步研究，有助于回答“基因变异如何导致疾病”，将基础机制与PD病理关联。作者在HEK293T细胞中过表达带标签的hTMEM175-M393T，发现M393T的H+通透性和K+通透性及对激动剂DCPIB的响应与WT无显著差异，M393T突变本身不改变通道的内在离子选择性或门控特性。于是作者构建了一个更接近生理的模型，作者在HEK293T细胞中利用CRISPR-Cas9创建M393T敲入（KI）细胞系，即在内源性TMEM175基因位点引入M393T突变。与WT相比，M393T KI细胞的内源性溶酶体H+电流幅度显著降低约50%。

当过表达时，人为的高表达可能掩盖了M393T对蛋白表达量和定位效率的影响。在KI模型中，在内源启动子调控下，M393T变异导致TMEM175在溶酶体上表达降低或定位效率下降，从而减少功能性TMEM175的数量，最终导致H+电流减小，这也与此前关于M393T的研究相符合，即M393T主要影响TMEM175的细胞内运输/稳定性，而非其孔功能。

Fig4. 管腔质子激活TMEM175及孔突变体功能解耦

前文已经证明TMEM175是管腔H+激活的H+选择性通道，并且发现ArA和DCPIB可激活TMEM175，由此延伸出：激活TMEM175是否能真正触发其核心功能——介导溶酶体内H+外排？

作者对过表达pHluorin（激发比率型基因编码探针，H+结合后荧光淬灭）的HEK293T细胞应用pHE7.2的浴液，通过胞质pHi成像监测H+流入胞质。发现应用DCPIB或ArA可导致胞质显著酸化。用甘氨酰-L-苯丙氨酸2-萘胺（GPN）预处理可以去除溶酶体H+梯度，消除了DCPIB或ArA的效果，说明TMEM175激活引起的H+流出完全依赖于溶酶体的H+储备，排除了其他H+来源。在DCPIB诱导GPN预处理的WT细胞中观察到微弱pHi降低，但在TMEM175 KO HEK293T细胞中未观察到，这表明内源性TMEM175的化学活化足以诱导溶酶体H+释放，并且DCPIB对溶酶体H+释放的影响是由TMEM175介导的。

作者进一步对溶酶体腔pH成像，直接检测腔室pH水平。作者通过使用pH敏感染料（pHrodo™ Green Dextran）和pH不敏感染料（CF™555 Dextran），计算两者比值，当比值下降时，溶酶体发生碱化。作者以使用Baf-A1作为阳性对照，使用ArA及DCPIB刺激WT细胞，发现溶酶体显著碱化，并且TMEM175 KO可以取消这种效果。作者使用LRRC8A KO作为功能性对照，在LRRC8A KO细胞中使用DCPIB，仍可见溶酶体碱化，排除了DCPIB的非特异性效应。TMEM175激活直接导致溶酶体腔碱化，是其作为H+外排通道的直接证据。

Fig5. 激活TMEM175诱导溶酶体质子释放

在前文中，作者已证明TMEM175是管腔H+激活的H+选择性通道，且其激活可诱导溶酶体H+外排。那么，TMEM175的H+电导如何维持溶酶体功能呢？其缺失如何引发功能奔溃？

作者在多种TMEM175 KO的细胞系中进行LysoTracker™ Red染色（pH敏感性溶酶体示踪剂），发现LysoTracker信号显著增强，这表明TMEM175敲除的溶酶体过度酸化。作者进一步使用三种不同的比率荧光染料测定溶酶体pH，也可以看到TMEM175 KO细胞的溶酶体存在过度酸化，而作者使用低剂量Baf-A1部分抑制V-ATPase，可以将TMEM175 KO细胞pH矫正至正常范围，证明溶酶体过度酸化源于H+泄露。当作者在TMEM175 KO细胞中重新表达野生型TMEM175和S45A突变体（部分丧失K+通透性但H+正常），这种溶酶体过度酸化得到逆转，而重新表达D41A（丧失H+通透性但K+正常）则无法纠正溶酶体pH。结合前面ArA/DCPIB对溶酶体pH的影响，这些结果表明，TMEM175的H+电导而非K+电导是调节溶酶体pH稳态所必须的。

溶酶体中蕴含的多种酸性水解酶是溶酶体发挥功能的重要组分，那么，溶酶体酸化如何导致功能性奔溃呢？作者在TMEM175 KO细胞中检测了总体水解活性、组织蛋白酶B（CatB）活性及组织蛋白酶D（CatD）活性，发现这三者都出现了降低，并且作者在蛋白水平检测CatB/CatD表达量，并未发生改变，也就是说TMEM175缺失选择性抑制水解酶活性而非表达量下降。紧接着作者通过回补功能解耦突变体，观察H+通透性的必要性。在回补TMEM175而非D41A后酶活性得到恢复，说明仅TMEM175的H+通透性而非K+通透性是维持水解酶活性的关键。作者进一步用低剂量Baf-A1将细胞溶酶体矫正到正常范围，TMEM175 KO细胞在pH正常化后，酶活性得到逆转，说明过度酸化是酶活性抑制的唯一直接原因。

Fig6. TMEM175的质子通透维持溶酶体稳态与功能

TMEM175被认为是PD的遗传危险因素，PD的一个标志性病理改变是大脑中的α-突触核蛋白（α-syn）聚集，而α-syn是CatB/D的已知底物，而作者在前文中已经证明TMEM175缺陷会导致溶酶体过度酸化以及CatB/D活性下降，那么α-syn清除障碍是否是由TMEM175缺失所导致的呢？

为了在活体动物模型中验证TMEM175功能缺失的病理后果，作者利用CRISPR-Cas9制备TMEM175-/-小鼠，在从TMEM175-/-小鼠分离培养的海马神经元中，作者证明了TMEM175在介导LyPAP、调节溶酶体稳态pH、激动剂响应及CatB活性中发挥重要作用，TMEM175缺失在神经元中同样导致溶酶体酸化和水解障碍。

作者模拟PD病理，在脑内注射外源性α-syn纤维，作为“种子”招募内源性α-syn错误折叠，加速非老龄鼠α-syn聚集。作者发现TMEM175-/-小鼠pS129-α-syn聚集斑数量和面积相比WT小鼠明显增加，并且聚集多位于纹状体投射区，这也是PD的关键病变区，说明TMEM175缺失显著促进α-syn病理性聚集。

Fig7. TMEM175缺陷导致小鼠α-syn病理聚集

03 结束语

作者通过细胞模型和动物模型对TMEM175的功能进行探索，从发现LyPAP电流-筛选候选分子-验证必要性-验证充分性-病理关联展开，明确了TMEM175缺失介导溶酶体过度酸化，损害CatB/D活性，导致α-syn降解障碍，聚集增加，从而诱发PD神经病理，为PD治疗提供了分子靶点。

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