微精选

泛素（Ubiquitin）是一种只有76个氨基酸残基的小蛋白，高度保守，在真核细胞中广泛存在。可以与蛋白质赖氨酸残基通过异肽键共价结合。泛素本身具有7个赖氨酸残基，因此它可以与自己相连，组成多种类型的泛素链。针对不同类型的泛素链有不同的读码酶，泛素因此可以调节蛋白质的多种活动，包括识别旧的、错误折叠或损伤的蛋白，把它们送进“蛋白酶体”进行分解、参与DNA修复、信号转导、有丝分裂调控和免疫信号调节。

泛素化是一个ATP依赖的三级酶系统，分“泛素激活、转移、标记”三步，由E1、E2、E3三种不同类型的酶参与调节。

E1是210kDa的同源二聚体，是整个泛素化的关键步骤。泛素本身稳定，不具有反应性。E1用ATP将其“激活”为泛素-AMP中间体，再与E1的半胱氨酸巯基形成高能的泛素-E1硫酯键，这个形式的中间体才能与E2进行反应。泛素从E1断开，转移到E2上的半胱氨酸巯基上，形成新的泛素-E2硫酯中间体。

E2分子量为35kDa，E3是约300kDa的多亚基复合物。E3识别目标底物，将其拉近E2，泛素从E2的硫酯键上断开，共价连接到底物赖氨酸侧链上的ε-NH₂，形成稳定的异肽键（isopeptide bond）。稳定的异肽键决定了泛素化修饰不会被碱性或羟基破坏，使泛素化成为一种强烈的、指向明确的生物学信号，是泛素“指令”的基础。细胞中有去泛素酶（DUB），可以剪掉泛素链，让系统可逆、可调节。

人体中的E1有两种，功能类似，非决定特异性；E2约有35种，对不同类型的泛素链存在偏好；E3有大于600种，决定底物识别，是特异性核心。

真核细胞包含6000到30000种蛋白质编码基因和众多蛋白质。一直以来，蛋白质的合成方式受到广泛关注，相比之下，蛋白质的降解过程并没有引起研究者过多的关注。1942年，研究者利用同位素示踪发现，动物体内的蛋白质是不断合成又不断降解的，处于一种动态平衡状态。但当时，研究者们普遍认为蛋白质的降解和油漆老化、衣服磨损一样，是一种被动过程。

自然界中大部分的酶类降解蛋白质都属于非耗能过程。然而1953年，Simpson在离体培养的肝脏切片中发现，蛋白质的降解是ATP依赖的，这跟食物消化中像胰蛋白酶（trypsin）那种不需要能量的蛋白酶降解机制形成了鲜明对比。有能量参与这个过程，那么蛋白质的降解很有可能是被调控的而非无序的。但Simpson的研究当时未能得到重视，学界当时更为关注溶酶体，一段时期内，溶酶体被视为胞内“垃圾桶”，无选择性地降解蛋白质。直到Hershko等人开始思考：既然蛋白质水解本身不需要能量，那么能量被用来做了什么？

1970-1971年间，Hershko在G.Tompkins实验室从事关于酪氨酸氨基转移酶（tyrosine aminotransferase）在培养的肝癌细胞中能量依赖性降解的研究，他们发现，ATP 在酶降解的早期阶段中充当能量来源，ATP可能并非用于直接水解蛋白质，而是参与某种调控机制。这一思路奠定了泛素系统研究的核心逻辑基础，是整个发现路径的思想起点。

1977年，Etlinger 和 Goldberg建立无细胞系统（cell-free system）。他们将细胞破碎后提取其中的成分（如酶、蛋白质、核酸、离子等），在体外构建一个模拟细胞内反应环境的体系，使得某些生物学反应（如蛋白合成或降解）可以在不依赖完整活细胞的条件下发生。研究蛋白质降解的无细胞系统的常规细胞裂解液来源包括哺乳动物细胞、兔网织红细胞。利用无细胞系统，Etlinger和Goldberg发现蛋白水解活性在 pH 约为7.8 时达到最优，这意味着降解活动不太可能是由溶酶体作为主要环节调控的，因为溶酶体中大多数蛋白酶的最适pH是在酸性范围内的。

同年，一种可以共价连接在组蛋白上的仅由76个氨基酸组成的小蛋白被正式鉴定为泛素。但在当时研究者门并没有意识到这个小蛋白的潜在价值，并且由于最开始将其划分在能量代谢相关领域，Hershko等人研究ATP依赖的蛋白降解时并未注意到这个小蛋白。直到1980年，研究者们才确认Hershko等人分离得到的ATP依赖的蛋白降解的关键组分就是泛素。

1978年，Ciechanover、Hershko和Irwin利用DEAE-纤维素柱去除网织红细胞裂解液中的血红蛋白。DEAE是一种常见的阴离子交换柱，它带正电，因此可以结合负电荷的分子（如蛋白质、DNA）。不同蛋白质根据其等电点和柱子的pH条件，在这个柱子上结合强度不同，可以被不同浓度的盐或缓冲液洗脱。裂解液通过DEAE柱之后，Ciechanover等人并没有只关注去除血红蛋白之后的目的产物，而是采用不同浓度的盐溶液洗脱，并对每一个洗脱组分做了功能测试。

他们发现，实验采用的兔网织红细胞裂解液（reticulocyte lysate）具有完整的 ATP依赖蛋白质降解能力，但裂解液通过DEAE之后洗脱下来的两种组分每一个单独都不具有降解能力，混合后恢复完整的 ATP 依赖性蛋白降解能力。第一个组分中鉴定出一种耐热的小分子蛋白，分子量约为 9000，他们将其命名为 APF-1（后于1980年鉴定为泛素）。第二个组分可以进一步通过盐沉淀分离出两个部分：一个是在ATP存在下稳定的、分子量约为 450 kDa 的蛋白复合物 —— 这很可能就是蛋白酶体（proteasome）。另一个部分则包含了后来的E1、E2 和 E3 泛素连接酶。

1980年，Ciechanover等人用125I标记APF-1，发现这个小蛋白能共价结合到多种裂解液中的蛋白质上。之后他们将标记物换成了三种底物蛋白：溶菌酶（lysozyme）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin）和球蛋白（globin）。结果发现，这些底物可以连接多个 APF-1 分子，即：一个底物分子上可以连接多条APF-1多肽链。进一步实验发现：1. 这种结合对碱性和羟胺具有抗性，提示结合方式可能是通过赖氨酸残基的ε-氨基形成的酰胺键。这说明APF-1与底物之间的连接是共价的，是特异性的酶促反应，而不是聚合、吸附或非特异性粘连；2. 在裂解液中还发现了一种酶，可以将底物上的APF-1释放下来，即后来的去泛素化酶（DUBs）。

这些发现改变了原有的研究思路。原本研究团队是希望寻找一种ATP依赖的蛋白酶，但现在他们转而开始尝试鉴定能够将APF-1（即泛素）共轭到底物蛋白上的酶系统。

Hershko等人推测：由于泛素具有高度保守的氨基酸序列，并广泛存在于不同的真核生物中，因此很可能泛素介导的ATP依赖性蛋白降解是一种具有普遍重要性的机制。此外，Wilkinson 等人提出，ATP的作用虽然参与的是放热反应（理论上不需要耗能），但它的加入是为了实现对反应的控制和特异性调节。

Fig2. 泛素修饰底物蛋白 （https://www./prizes/chemistry/2004/advanced-information/）

1981年，Ciechanover在实验中观察到：当向网织红细胞裂解液中加入焦磷酸盐（pyrophosphate，PPi）时，ATP依赖性蛋白质降解受到抑制。PPi是腺苷转移反应的产物，外源性补充PPi可以推动反应向左逆转，从而抑制腺苷转移。这提示：ATP依赖性蛋白质降解属于腺苷酸转移型的激活机制。

此前已有数据表明，泛素与底物蛋白之间的异肽键连接中羧基部分来自泛素，因此可以得出是泛素的C端羧基与ATP作用，形成泛素-AMP中间体，后来这个活化的羧基与E1的巯基（-SH）形成硫酯键。即泛素是该激活反应的靶标。

生物化学中蛋白质之间可能形成的共价键类型是有限的，最常见的共价键包括酰胺键（不能被碱和还原剂破坏）、酯键（少数能被还原剂破坏）和硫酯键（能被碱和还原剂破坏）。根据这些共价键的特性，研究者通过标记的硼氢化钠（NaBH4，强还原剂）还原裂解中间产物，进行水解和氨基酸分析，确定了泛素的C端甘氨酸残基是被激活的关键位点，泛素与E1以硫酯键相连。

在对E1的纯化过程中，研究人员开发了一种优雅的共价亲和层析方法。这项技术后来也被用于E2和E3酶的分离。当将含有E1的网织红细胞裂解液与ATP共同处理后，加载到一个与泛素共价连接的Sepharose层析柱上时，发现：有50%的“泛素依赖性ATP-焦磷酸交换活性”被保留在柱上。如果不加ATP，则没有酶能结合柱子。这些结合的酶无法被1M KCl洗脱，但将pH升高至9，且加入DTT（还原剂）则可以洗脱出来，也可以用AMP+焦磷酸盐洗脱。说明这种酶与柱上的泛素之间形成了可逆但稳定的化学连接（即硫酯键）。通过这种方法，E1得以被纯化至单一组分，并被证实是一个210 kDa的同源二聚体。

Hershko等人认识到，E1本身无法将泛素连接到目标蛋白上，并且他们注意到，即使在没有ATP的条件下，网织红细胞裂解液通过泛素柱时也会导致整体蛋白降解活性明显下降。而E1只有在ATP存在时才会结合柱子，说明泛素系统中还有其他成分也能与柱子上的泛素结合。

因此他们继续使用刚开发的“泛素-Sepharose亲和柱”纯化出另外两种酶：E2和E3。他们在有ATP时加载样品再用不同方式洗脱，高浓度盐溶液洗脱得到E3，AMP+焦磷酸盐洗脱得到E1，还原剂DTT洗脱得到 E2。最后混合这些组分加入泛素、ATP和底物，观察到完整的ATP依赖性蛋白降解得以恢复。

随后他们进一步用凝胶过滤层析（分子大小分离）进一步纯化这些酶，得出E2约为35kDa，E3约为300kDa。

E2要结合到柱子上，必须要有E1 + ATP，说明它是通过E1传递泛素后，形成带有硫酯键的E2-泛素中间体。E3不需要E1或ATP就能结合柱子，而且可被盐洗脱，表明E3是非共价结合。这些组分的“泛素连接活性”与它们的“蛋白降解活性”完全匹配。说明E1、E2、E3不仅是连接酶，也是蛋白降解系统中的核心酶。

碘乙酰胺（Iodoacetamide）是一种烷基化剂，会选择性烷基化半胱氨酸的巯基。研究者利用它抑制E2活性，发现如果事先用E1+ATP+泛素处理过，就能阻止抑制发生。说明E2中有一个对碘乙酰胺敏感的巯基（-SH），这个巯基在泛素转移过程中被占用。接着他们用放射性标记的泛素（125I-ubiquitin）在SDS-PAGE电泳中观察泛素如何转移：E1-泛素形成的硫酯键在电泳中非常稳定，不会解离。当加入E2后，可以在胶上看到泛素从E1转移到E2的过程，即使用己糖激酶除去ATP后，也能完成这个转移，说明转移本身不需要额外ATP。但泛素不能直接从E1转移到E3，而是转移给了E2，与E2形成新的硫酯键，E3将E2携带的泛素转移到底物蛋白上形成酰胺键，完成泛素化修饰。

整个泛素化反应链路如下：ATP激活泛素 → 泛素转移到E1（硫酯）→ 转移到E2（硫酯）→ 在E3辅助下接到底物赖氨酸（酰胺键）→ 可继续重复形成多聚链。

Fig3. 泛素反应链路 （https://www./prizes/chemistry/2004/advanced-information/）

所有这些研究最初都是在无细胞系统中完成的。为了在真实细胞中验证泛素介导的蛋白降解机制，Hershko等人开发了一个免疫化学方法：用色氨酸（tryptophan）脉冲标记细胞内新合成的蛋白（泛素中不含色氨酸，可用于区分底物和泛素），并使用抗泛素抗体富集泛素化底物。结果发现在使用氨基酸类似物诱导异常蛋白合成后，泛素结合蛋白显著增加，这些结合物被快速降解。这一现象不仅在网织红细胞中出现，在Ehrlich腹水瘤细胞中也被观察到。这一实验现象说明，泛素介导的蛋白降解机制可能专门清除细胞内异常或错误折叠的蛋白，但不排除它也参与其他蛋白的分解。

现在的研究表明，细胞中多达30%新合成的蛋白会因为没有通过质控系统而被泛素化降解（Alberts等, 2002）。

E1、E2、E3的共同作用，将泛素以ATP依赖的方式与目标底物相连，这一过程可以重复，最终形成不同类型的多泛素链，被不同的读码酶识别进入下一个生物环节。

蛋白酶体是ATP驱动的蛋白降解机器，在生物学的历史上被多次发现并被赋予了不同的名字。到二十世纪九十年代末期，它的存在才引起了研究者们的重视。蛋白酶体既存在于细胞核中，也存在于细胞质中，19S复合物与20S核心颗粒共同组成完整的26S蛋白酶体，总分子量约为2500 kDa。另外还有一些变体组合。它的活性位点被包裹在其桶状的20S核心结构内部，从而避免受到细胞内环境的影响。

被多泛素链修饰的底物蛋白会被蛋白酶体的19S调控亚复合物识并折叠，进入20S核心结构中进行降解只剩下7～9个氨基酸长的小肽段。此外，19S复合物中还含有一种异肽酶（isopeptidase），能将泛素从底物蛋白上剪切下来。

Fig4. 泛素和蛋白酶体介导的蛋白质降解（Lodish，Molecular Bioscience，8th edition）

泛素依赖的蛋白降解系统因缺乏遗传学证据和高度可控的模型系统，在一开始并没有引起广泛的关注。直到1980年Yamada及其团队发现的ts85细胞系彻底改变了这一局面。

1977年，研究者发现泛素这一小蛋白时，就发现单个泛素会以共价形式结合在组蛋白H2A上，研究者将这个修饰过的蛋白称为A24。但直至目前，组蛋白H2A的确切功能仍不清楚。1980年，Yamada及其合作者为探索染色质凝缩和细胞周期进程的关系筛选出一种温度敏感突变体细胞系ts85，在非允许温度下细胞周期可被阻滞在G2期，此时ts85突变体表现出异常的染色体凝缩现象，同时其组蛋白磷酸化缺失，ts85细胞中泛素化的组蛋白H2A（也就是称为A24的蛋白）快速消失，而恢复至允许温度后又重新出现。而这种“消失现象”在野生型细胞和ts85的回复突变体中都没有观察到。随后这个日本研究小组证明了H2A的泛素化需要ATP，结合前面的实验现象，他们推测在非允许温度下泛素化H2A的消失，很可能是因为其合成路径的抑制，而不是降解功能的激活。他们由此推测，ts85突变影响的是泛素化过程中的某种酶。Finley等人于1984年证实这个热不稳定酶就是E1，E1功能缺失则泛素化无法进行。这些结果证明，泛素系统的作用不仅仅是降解异常蛋白，它还参与调控细胞周期、DNA复制和染色体结构等重要的细胞生理功能，同时明确了E1是泛素化级联反应的限速步骤和必需起始点。

20世纪80-90年代，泛素参与细胞周期调节的证据被众多研究者进一步做实。1988年，一种已知调节细胞周期的酵母因子 Cdc34被发现属于进化上保守的泛素连接酶 E2酶家族。泛素介导降解在控制细胞周期中的重要性，得到了 M. Kirschner 实验室的直接验证：他们发现，细胞从有丝分裂中退出所必需的是 泛素介导的细胞周期蛋白（cyclin）降解。他们还发现了位于细胞周期蛋白N端的一个靶信号，称为“破坏盒”（destruction box）。2001年，研究者鉴定出负责该降解的 E3 酶是有丝分裂促进复合物（APC/C），它是一个多亚基酶复合物，也在有丝分裂和减数分裂过程中染色体的分离中发挥关键作用。

此外，1989年，Finley等人发现，泛素会与核糖体蛋白N端暂时结合，参与核糖体的高效生物合成。

1996年，Hicke等人发现膜蛋白（如受体）的单泛素化可作为其内吞的信号，这说明，泛素化不仅与降解相关，也在内吞作用和分泌等靶向转运中发挥重要功能。

p53 被称为“基因组守护者”，在人类约 50% 的癌症 中发现其基因发生突。1997年，Honda等人发现p53的降解由泛素介导。E3酶Mdm2会与 p53 形成复合物，促进p53降解，正常细胞中肿瘤抑制蛋白 p53 的水平因此可以通过持续的合成和降解维持在较低水平。在 DNA 损伤之后，p53 蛋白会被磷酸化，从而降低其与 Mdm2 的亲和力，抑制其被降解，导致细胞内 p53 水平升高。p53 是一种转录因子，可以结合到某些基因启动子的特定位点，调控细胞周期停滞、DNA修复以及程序性细胞死亡（凋亡）等过程。DNA 受损后，p53 表达上升，引起细胞周期停滞以便进行修复，如果损伤过于严重，则启动细胞凋亡。这一发现为癌症治疗提供了新的思路和靶点。

03 结束语

04 参考文献