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【导读】

     人体的TLR4受体可以被Gram阴性细菌产生的内毒素（脂多糖，LPS）识别，从而启动免疫反应，对抗Gram阴性细菌。但在科学史上，LPS的受体是如何被发现和鉴定出来的？

     今天分享的是由Bruce Beutler于1998年发表在Science上的一篇文献，Bruce Beutler也由于这项鉴定出TLR4是LPS的受体的工作，而获得2011年诺奖。

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01 研究结果

    Gram阴性细菌能产生LPS，强效激活宿主的单核-巨噬细胞，诱导肿瘤坏死因子（TNF）及其他毒性细胞因子的产生，引发败血症。但同时，研究表明固有免疫细胞对LPS的及时识别在有效清除Gram阴性细菌、防止细菌进一步扩散中发挥重要作用。

    30多年前，C3H/HeJ品系小鼠被发现对LPS的反应缺陷。遗传学研究表明Lps这一单位点上的Lps^d共显性等位基因的纯合子导致了对LPS的反应缺陷。

    另一个导致对LPS反应缺陷的基因突变被发现于C57BL/10ScCr品系小鼠。由于C57BL/10ScCr和C3H/HeJ杂交产生的F1代也和亲代一样对LPS反应缺陷，这两种品系小鼠发生突变的基因是等位基因。此外，C57BL/10ScCr和C57BL/10ScSn（野生型）杂交后代并没有表现出LPS反应缺陷，所以C57BL/10ScCr发生突变的等位基因是隐性的。

Lps的突变被认为影响了LPS信号转导系统中的蛋白。Ulevitch、Tobias、Wright等的研究表明胞膜受体CD14是单核细胞膜表面重要的LPS受体。敲除CD14显著升高了引起生物反应所需要的LPS含量。但CD14缺少胞内结构域，所以理应有另一个共受体能够将LPS信号转导到胞内。一些蛋白激酶级联反应被发现被LPS所激活，从而导致TNF等细胞因子的产生。但直接的生物化学、免疫学和cDNA克隆技术尚未鉴定出LPS反应缺陷小鼠基因中的突变部位。

    在1978年，Lps位点被发现定位在小鼠4号染色体，位于Mup-1和Ps这两个位点之间。本课题组的遗传图谱和物理图谱数据从Lps^d中鉴定出了两个限制性遗传标记（B、83.3）。利用GLAST和GRAIL分析，在排除掉假基因后，只有两个真基因被鉴定出：Pappa基因片段和Tlr-4完整基因。Pappa编码基质金属蛋白酶，不被巨噬细胞表达，且Pappa非常接近于B这个遗传标记。因此Pappa不符合条件。而Tlr-4是一个非常有可能的候选者：有种人类基因突变导致同时对LPS和IL-1反应缺陷，这说明LPS受体和IL-1受体的结构具有相似性，而IL-1受体和Tlr4同属于Toll样受体家族成员。

Figure 1: 包括Lps关键区域的2.6 MB重叠群的一小部分。49K20、309I17、152C16是包含Pappa基因片段和Tlr-4完整基因的BAC。B和D4MIT178是最靠近Lps^d的遗传标记。4/1600和0/2093是基因图谱数据（交叉次数/减数分裂次数）。

    因此，研究人员利用RT-PCR扩增了C3H/HeJ和其他正常品系小鼠的Tlr4 cDNA。在C3H/HeJ小鼠的Tlr4 cDNA的第2343位碱基处发现了单突变。该突变位于编码区，它导致蛋白的712位氨基酸由脯氨酸变为组氨酸。

Figure 2: Lps^d基因具有一个错义突变，影响了Tlr4的胞内结构域。利用RT-PCR对小鼠腹腔巨噬细胞中分离出的mRNA进行反转录、扩增获得小鼠Tlr4 cDNA的全部编码区域，长2951 nt。该cDNA预测对应835个氨基酸长的蛋白。第712位氨基酸由脯氨酸突变为组氨酸（Pro -> His），该位点位于Tlr4中最保守的部分，且位于胞内区。

    虽然利用RT-PCR能够从C3H/HeJ、C3H/HeN和C57BL/10ScSn小鼠巨噬细胞mRNA中扩增得到Tlr4 cDNA，但却不能从C57BL/10ScCr小鼠中得到。Northern Blot的结果也表现一致。

Figure 3: C57BL/10ScCr小鼠不能表达Tlr4 mRNA。（A）；利用RT-PCR对多种不同小鼠巨噬细胞的mRNA进行反转录和扩增，可获得2.6 kB的Tlr4扩增产物，但C57BL/10ScCr小鼠来源的cDNA没有获得该产物。（B）Northern blot结果表明C57BL/10ScCr小鼠巨噬细胞中没有检测出Tlr4 mRNA。

在明确了C3H/HeJ小鼠Tlr4基因中的点突变、以及C57BL/10ScCr小鼠中Tlr4 mRNA表达的完全缺失后，我们可以得出很明显的结论：Lps就是Tlr-4。

    在C57BL/10ScCr小鼠中，Lps的无效等位基因（θ）是隐性的，因此只要存在一个野生型等位基因，小鼠就能对LPS产生正常反应。研究发现Tlr4^Lps-n（野生型等位基因）/Tlr4^Lps-d小鼠表现出中等水平的LPS反应，因此C3H/HeJ小鼠中Tlr4点突变等位基因是共显性的。Tlr4^Lps-d/θ和Tlr4^Lps-d/Lps-d的表型相同。

    本研究还发现LPS处理巨噬细胞系RAW264.7导致了Tlr4 mRNA的降低，这可能导致对LPS的反应耐受。

Figure 4: LPS刺激RAW264.7抑制了Tlr4基因的表达。

    此前有研究表明在293细胞中转染人Tlr2 cDNA和CD14能够诱导出LPS信号转导。本研究排除了Tlr2作为LPS独立受体的可能性，因为在缺少Tlr4基因的小鼠中（如C57BL/10ScCr），正常表达的Tlr2并没有使小鼠具有对LPS的正常反应。

    Hu等人的研究表明鸟中Lps不同等位基因影响受到Gram阴性细菌感染后的存活率，有可能人类的Tlr4的突变也会影响人对Gram阴性细菌感染的敏感性。

02 总结

    综上，Bruce Beutler通过对LPS反应缺陷小鼠的突变位点Lps进行鉴定，发现Lps位点中包含Tlr4基因，鉴定出了TLR4是LPS的作用受体。

补充知识点

共显性等位基因（codominant allele）
    如下图所示，R和r为一对等位基因，R表达红色性状，r表达白色性状，R和r都是显性性状。此时，R和r互为共显性等位基因。

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