微精选

点击跳转原文

（全文约5497字，阅读约需25分钟。有需要的朋友可点击右上角菜单中的”调整字体”，设置文字大小，方便查看）

01 研究背景

脊椎动物通过外周神经元对外界刺激做出反应，并将信息传递到高级中枢进行处理，从而分辨出复杂的感觉信息。阐明外周神经系统如何识别外界刺激，有助于我们理解感知处理背后的逻辑原理。我们对色调的识别仅仅通过3种感光细胞的信息融合就能完成，这一发现极大加深了我们对色彩视觉的生物学基础的理解。然而，人类是如何实现对数以万计的气味进行识别的，尚未可知。气味分子在结构上的一点细微变化就可以导致截然不同的气味感知，这说明嗅觉感知具有非常鲜明的多样性和特异性。

对这些种类繁多、结构各异的气味分子的识别很可能是由鼻子中的嗅上皮上特定的受体所完成的。这些受体可能有两种情况：一是嗅觉可能与视觉类似，由少数几种嗅觉受体所介导，每种嗅觉受体可识别大量不同的气味分子；二是存在非常多的嗅觉受体，每一种受体仅识别一种或少数几种气味分子。对嗅觉受体的分离和鉴定以及对其多样性、特异性和表达特征的阐明，将帮助我们理解嗅觉感知的生物学机制。

鼻子的嗅上皮中主要有3种细胞：嗅觉感觉神经元、支持细胞和基细胞（干细胞，终身可分化为嗅觉感觉神经元）。嗅觉感觉神经元是一种双极神经元，一端伸向鼻腔黏膜表面，形成特化的嗅纤毛，而另一端投射到脑中的嗅球——嗅觉系统的第一中继站。已有研究发现，切除嗅纤毛导致了嗅觉丧失，因此很有可能是嗅纤毛上的受体负责识别气味分子。此外，将大鼠的嗅纤毛与多种气味分子接触后导致了腺苷酸环化酶的迅速激活以及cAMP的大量增加。升高的cAMP通过激活环核苷酸门控阳离子通道，使嗅觉感觉神经元发生去极化。

上述发现提示了嗅觉信号传导可能依赖的机制：气体分子结合嗅纤毛表面特定的受体，导致G蛋白的激活，进而通过胞内信号通路导致嗅觉感觉神经元动作电位的产生。现有研究已阐明，一些神经递质和激素的受体通过激活特定G蛋白来传递胞内信号，并且基因克隆结果表明这些受体均属于具有7次跨膜结构的表面受体超家族。对嗅觉信号传导的研究提示我们，嗅觉受体很可能也属于这一超家族。基于这一重要假设，研究人员开始了嗅觉受体的分离与鉴定工作。

Figure 1: 嗅上皮结构和嗅觉信号传导通路

02 实验设计与研究策略

首先，分离嗅觉受体的研究策略是根据以下3个假设而制定的：①嗅觉受体可能是通过偶联GTP结合蛋白来传递胞内信号的表面受体蛋白超家族，②嗅觉受体可能是由一个庞大的多基因家族所编码，表现出显著的多样性，③嗅觉受体选择性表达于嗅上皮。

基于上述假设，研究人员采用PCR，从嗅上皮的RNA中扩增了7次跨膜蛋白受体超家族的类似物。进一步，每一种PCR扩增产物是单一DNA序列、还是多种DNA序列的混合物？研究人员猜测，如果PCR扩增产物是单一的DNA序列，那么采用限制性酶切所产生的DNA片段的分子量之和应该恰好等于该扩增产物的分子量；反之，如果是多种DNA序列的混合物，那么限制性酶切后的DNA片段的分子量之和应该远大于该扩增产物的分子量。

03 重要研究结果

Figure 2: 对大鼠嗅上皮进行PCR，然后对得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（A），利用限制性内切酶Hinfl对上述电泳条带产物进行酶切和电泳（B）。其中，第13个泳道的PCR扩增产物在酶切后产生了多个片段，这些片段的大小之和远大于该扩增产物本身的大小，提示第13个PCR扩增产物包含多种DNA，可能属于一个多基因家族。

进一步，研究人员利用限制性内切酶对这些PCR扩增产物进行酶切，然后进一步进行电泳。结果表明，大多数PCR产物经过酶切后的条带的大小之和等于PCR产物本身的大小，表明这些产物只包含单个DNA。但是，第13个PCR产物经过酶切后所产生的DNA片段的大小之后远大于该产物本身的大小（710 bp），是原产物大小的5-10倍。这说明第13个PCR扩增产物包含多种DNA，并且这些DNA可被同一对引物（A4/B6）所扩增。

为了进一步确认第13个PCR扩增产物所编码的蛋白是否属于7次跨膜受体超家族，研究人员将该产物克隆进Bluescript质粒中，然后对质粒的其中5个单一克隆进行DNA序列分析，结果表明这5个克隆所编码的蛋白均具有7次跨膜受体的保守特征。但是，他们所共有的特征性序列又与其他已发现的7次跨膜受体家族所不同，说明他们属于一个新的受体家族。

为了进一步获得完整的cDNA克隆，研究人员对从嗅上皮RNA或纯化的嗅觉感觉神经元RNA反转录后的cDNA文库进行了筛选。采用第13个PCR扩增产物的DNA以及利用A4/B6引物对大鼠全基因组DNA或嗅上皮cDNA文库进行扩增所获得的DNA作为杂交探针。进一步利用A4/B6引物对杂交斑块进行PCR扩增，然后纯化那些仅产生710bp大小的PCR产物的克隆。实验结果表明，从纯化的嗅觉感觉神经元的cDNA中所获得的阳性克隆的出现频率大约是从嗅上皮cDNA中获得阳性克隆的5倍。

利用A4/B6引物对上述20个cDNA克隆进行PCR扩增，然后用³²P标记扩增产物，将这些³²P标记物作为探针，分别与不同组织的cDNA文库或RNA进行杂交，结果表明只有嗅上皮RNA杂交产生了2 kb和5 kb大小的条带，而脑和脾没有检测到杂交条带。因此，研究人员鉴定出的这一新的编码7次跨膜蛋白的多基因家族特异性地表达于嗅上皮，并且可能特异性地表达于嗅觉感觉神经元上。

Figure 3: 将分别来自大鼠嗅上皮、大脑和脾的poly (A)+ RNA进行甲醛-琼脂糖凝胶电泳并转印到尼龙膜上。采用与G蛋白偶联受体的跨膜域2和7同源的引物制备PCR cDNA，然后用32P进行标记。将32P标记的20个cDNA克隆混合物与上述尼龙膜进行杂交。

利用A4/B6引物从嗅上皮或嗅觉感觉神经元中扩增出的710 bp大小的不同克隆产物有18个，他们与第13个PCR产物具有相同的序列基序。对其中10种序列差异最大的克隆进行完整序列分析，研究人员发现这些克隆所编码的蛋白均具有7次跨膜受体蛋白的特征性序列和结构，但又具有不同于其他家族的特征，表明他们属于一个新的受体家族。

Figure 4: 由10个不同的cDNA克隆编码的蛋白序列

Figure 5: 嗅觉受体家族蛋白中的高度可变位点。白色表示在10个受体中≥60%都相同的位点，黑色表示可变性较大的位点。可见第3、4和5跨膜区的可变性很大。

Fig.6A展示的是这18种蛋白的第5跨膜区以及邻近的胞内环的序列。通过分析这些蛋白的第5跨膜区序列，研究人员发现，尽管第5跨膜区的序列可变性很大，但他们却可以被分为至少3个亚家族（Fig.6B-D）。比如在亚家族B中，这6种蛋白的第5跨膜区序列的相似性高达91%。研究人员猜测，不同亚家族可能识别不同结构类型的气体分子，而亚家族内的成员则负责分辨在结构上仅有细微差别的不同气体分子。

Figure 6: 嗅觉受体可根据第5跨膜区域分为3个亚家族

为了进一步探究该多基因家族的成员数量，研究人员进行了Southern blot。首先从Fig.4的10种可能的嗅觉受体的DNA中挑选了7种DNA，并合成第3跨膜区的3’端到第6跨膜区中间这一段的DNA，并进行标记。在证明了这些DNA探针之间很少形成交叉杂交后，研究人员采用限制性内切酶EcoRI（A）和HindIII（B）消化大鼠肝脏DNA，然后用上述DNA探针进行Southern blot。结果表明，除了第5对探针，其他探针都杂交产生了多个条带。而第7对探针杂交产生了大约17个条带。该结果表明，探针DNA所来源的基因可能分别代表不同的受体亚家族，内部成员数量从1个到17个不等。Southern blot中共检测到了大约70个条带，表明至少有70个受体成员。考虑到研究人员所挑选的探针DNA不可能包括所有的嗅觉受体亚家族，这一条带数量很可能只反映了一个下限。

进一步，研究人员通过筛选大鼠基因组文库，获得了对嗅觉受体多基因家族的成员数量的更准确的估计。结果表明，每个单倍体基因组中有100-200个阳性克隆，并且这一数量很可能也只是下限。总之，该嗅觉受体多基因家族包括100个至数百个成员，这些成员可被分为多个亚家族。

Figure 7: 分别采用限制性内切酶EcoRI（A）和HindIII（B）消化大鼠肝脏DNA，然后进行Southern blot。所采用的探针是从Fig.4的10种可能的嗅觉受体DNA中挑选的7种DNA的片段。这些片段之间不形成或很少形成交叉杂交。最右列的“1-7”是采用7种探针的混合物进行的Southern blot。

为了进一步验证该嗅觉受体在嗅上皮表达的特异性，研究人员从嗅上皮、脑、心、肾、肝等多个器官制备RNA文库，然后采用上述7种不同的cDNA探针进行Northern blot。杂交结果表明，只有嗅上皮的RNA中出现了大约5 kb和2 kb大小的条带。

从嗅上皮RNA中制备的cDNA文库中筛选到嗅觉受体阳性克隆的频率大约为1/20000，而纯化的嗅觉感觉神经元的cDNA文库的阳性克隆频率高5倍。假设每个嗅觉感觉神经元含有10万个mRNA，那么每个神经元表达大约25-30个嗅觉受体。结合上述实验结果，研究人员推测嗅觉感觉神经元表达的嗅觉受体具有显著的多样性。

Figure 8: 采用7种嗅觉受体基因来源的cDNA探针，对不同组织来源的RNA进行Northern blot杂交。

04 总结

该研究从实验设计开始就存在很多严密的推理。从嗅觉受体可能是GPCR、嗅觉受体可能特异性表达于嗅上皮、嗅觉受体可能是多基因家族这3个线索出发，研究人员针对GPCR的保守区域设计PCR引物，然后对嗅上皮的cDNA进行扩增，获得嗅觉受体基因，并且对该多基因家族的序列、分群、数量和解剖部位表达特异性进行了深入解析。

作者在讨论部分将嗅觉受体的多样性与利根川进发现的抗体多样性和T细胞受体多样性进行了比较。在漫长的进化过程中，生物体为了适应不断出现的新的配体（气体分子、抗原等），通过基因转换而形成了多基因家族。但是，不同于抗体多样性的产生来源于基因片段的重排，嗅觉受体基因序列中不存在恒定区，因此可能不涉及基因重排。

不同的嗅觉感觉神经元编码不同的嗅觉受体，那么表达相同嗅觉受体的神经元在解剖上的部位分布是如何的？他们又是如何将嗅觉信息向中枢传递，使大脑能够区分不同的气味的？研究人员给出了两种可能的模型：一是表达相同嗅觉受体的神经元在嗅上皮上聚集在特定解剖部位，从而在嗅上皮上形成不同神经元类型的地图；二是表达相同嗅觉受体的神经元在嗅上皮上不规则散布，但是他们共同投射到嗅球中的同一解剖部位，因此嗅球中的二级神经元的地图表征了嗅觉信息。

现在我们已经知道，小鼠有多达1000种不同的嗅觉受体；每个嗅觉感觉神经元只表达一种嗅觉受体；每个嗅觉受体可以被多种气味分子激活，而每个气味分子可以激活多个嗅觉受体，因此如果一种气味分子可以激活两种受体，那么1000种嗅觉受体的激活就有1000×999/2 = 499500种组合。目前已经证实，表达相同嗅觉受体的嗅觉感觉神经元在嗅上皮上混杂分布，不形成特定的空间聚集分布地图，但他们将轴突投射到同一个嗅小球，从而在嗅小球中形成分布地图，从而表征嗅觉信息。

05 重要研究结论

（接下来是夹带私货时间）

Eric Kandel的In Search of Memory这本书里面记载了他和Richard Axel的一个小故事。Richard和Eric都喜欢看歌剧，但Richard明显要更接地气一点。Richard带着Eric从小门溜进歌剧院，然后塞钱给里面的工作人员。虽然演出很精彩，但Eric表示自己时不时就冒冷汗，担心第二天《纽约时报》会刊登头条新闻：两位哥大教授被发现逃票看歌剧。

原文作者介绍 Author