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【原】手把手10分文章WGCNA复现:小胶质细胞亚群在脑发育时髓鞘形成的作用

【原】手把手10分文章WGCNA复现:小胶质细胞亚群在脑发育时髓鞘形成的作用

Hi大家好,我是老米!生信入门一个月,感谢生信技能树平台。这是我的第3篇Markdown。不知道多少人还记得我的前两个投稿:

手机投屏到智能电视 你知道哪几种方法?

微信群中、朋友圈里看到了一个搞笑的视频,该如何分享出来呢?一般情况下,可能大部分人都是在朋友圈中进行转发,但是如果是在聚会的时候,这样的转发可能就不太适宜了,这时候你需要的是找一台智能电视,然后将手机投屏到智能电视上。但是如何连接智能电视进行投屏呢?笔者这就介绍几咱方法告诉给大家。(如何才能比较畅快的投屏到智能电视上?)1、DLAN或AirPlay当下的手机都支持DLNA或AirPlay功能,简单地说,就是相当于PC中的网上邻居的功能,允许一台设备直接访问在同一网络中的其他设备的图像声音和视频资 更多

原来一个星期真的可以零基础入门TCGA数据挖掘,甚至markdown写作公众号投稿 

一个基因引发的血案

现在继续完成生信技能树的作业题:重复一篇WGCNA分析的文章。WGCNA学习教程:一文学会WGCNA分析。

复现的文献:A novel microglial subset plays a key role in myelinogenesis in developing brain。EMBO J,好杂志。

       小胶质细胞是神经系统中的巨噬细胞,可介导脑稳态和神经炎症。作用至关重要,但在大脑发育中具体机制尚未完全阐明。这篇文章中,通过对比健康成人和炎症激活(构建的实验性自身免疫性髓鞘炎模型EAE)的细胞群,发现新生鼠的小胶质细胞对于髓鞘生成及神经形成起关键作用。其中CD11c +小胶质细胞亚群在发育中大脑的髓鞘区域高表达,介导神经和胶质细胞的存活,迁移和分化。这些细胞是IGF1的主要来源,而选择性耗竭会该亚群可导致性髓鞘形成受损。 引用Jimmy的话:

值得一提的是,在单细胞水平研究小神经胶质细胞(Microglia)动态发育和异质性已经有了不少研究。

波士顿儿童医院的研究者们分析了超过76,000个来自于发育、衰老和脑部感染后的小鼠脑部的小胶质细胞,结果表明至少有9种转录特异的小胶质细胞形态,它们可以表达特定的基因集,且位于特定的脑区。发表于免疫学杂志Immunity, doi:10.1016/j.immuni.2018.11.004 (2019).

斯坦福大学医学院的研究者采用高深度scRNA测序揭示了小胶质细胞和脑髓细胞的发育异质性,发表于Neuron,这些细胞取自于胚胎期、出生后早期和成年的小鼠不同脑区。我们发现大部分的成年小胶质细胞表达稳定的基因(homeostatic genes),且不同脑区间没有差异。相反,出生后早期的小胶质细胞异质性更高。doi:10.1016/j.neuron.2018.12.006 (2019).

德国弗莱堡大学医学院神经病理学研究所的研究者采用单细胞RNA测序揭示小鼠和人的小神经胶质细胞的空间和时间异质性,成果最近以Letter的形式发表于Nature杂志。doi:10.1038/s41586-019-0924-x (2019).

       这些都是当前的脑发育研究的热点和前沿!(Jimmy老师,你知识怎么能这么渊博?我这个搞神经发育的都惭愧【捂脸】)

该文章对五个处理组,共17个老鼠:

orange represents neonatal CD11c+ microglia (n = 4),

green neonatal CD11c microglia (n = 4),

blue EAE CD11c+ microglia (n = 3),

purple EAE CD11c microglia (n = 3),

black adult microglia (n = 3).

其实就是 neonatal(新生的) 和 EAE的Microglia,还有CD11C阳性和阴性,然后和成年小鼠的Microglia进行比较。这些样本进行了RNASeq测序,数据在GEO可供下载:/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78809。当然我偷了个懒,该文章Supplemental material提供了整理之后的csv矩阵,大概1万3千个基因。

作者进行了WGCNA分析,以此证明小胶质细胞的作用及寻找关键信号通路及基因(嗯,估计这个实验室后续还有大文章出来)。

组学及生信分析的篇幅占了整个文章的一半以上。在此,仅重复文章的Figure3。

       其实我跌跌撞撞学了WGCNA半个月,大概了解了这个原理,现在还一知半解,对很多细节摸索了很久,头很大。下面进入正题,请大家一起跟着我头大。

结果如图:

       这结果挺好的,符合实验设计,都聚类好了。但是!但是如果不对原始数值进行log2处理,会出现一个outlier老鼠,如图:

       看到没,那个新生的NEO1号鼠有点调皮!他超脱于所有老鼠之上,统领其他所有老鼠!这要么是问题少年,要么是智商超群,比如科大少年班的那种!而我大概深究了一下,控制这个离群值的大概是500个基因,哈哈哈。。。

       专业名词叫多维标度法(Multidimensional Scaling)MDS,是一种维数缩减方法,把高维的数据点映射到一个低维的流形上;同时也是一种可视化方法,实践中通常利用2D或3D的MDS 结果观察(投影后)点的分布和聚集来研究数据的性质。实际上你也可以把它看做是PCA分析,反正都是看样本间的相关性计算距离远近。

说人话叫做:通过基因表达log2组间差异,看看这17个老鼠是否能够分到一个类别,比如成年鼠归到一类,EAE归到一类,新生鼠归到一类。和上面的有点类似,又不完全一样。

       参考学习了stat的视频,也参考了他提供的代码。如下:

结果如下:

       嗯,,,结果表示完美!别问我为什么要先做这个图,因为它好看,我忍不住!

点评:老米在这里开始秀技术了,实际上大家随便跑一下PCA分析即可,暂时无需深入写这么长代码!

       下面正式进入WGCNA分析。

  这个没啥好讲的,代码如下:

4. 采用一步法构建加权共表达网络

(weight co-expression network)

结果如下:

        这里需要停顿一下:SCI文章只取到8个模块,图注说用了12691个基因(被我发现全部加起来也才9999,没错!9999个基因)。事实上,能够分这么少模块,我不知道作者参数细节。有两个参数特别影响模块大小:

一个是minModuleSize,表示每个模块里面最少放多少个基因,这很好理解,设定越大,模块越少;

另一个是mergeCutHeight,这个参数表示你在哪里砍树。值设定越小,树枝越多,通常是0.25。

google一下,发现这么一个说法:

      这里,我的mergeCutHeight = 0.28,最终取到13个模块!

5. 模块与基因与表型

这是关键,其实就是开始解读这些关联的基因群对老鼠表型的影响,比如敲除CDC11之后的老鼠,哪些信号通路激活或抑制,EAE的老鼠哪些基因激活?等等等。

通过模块与各种表型的相关系数,可发现自己感兴趣的模块。如图:

可以看到有些模块与成年鼠关联,有些与EAE相关性很高。和原SCI的图有点像。

就是上面的图转化成bar图。

部分结果如下:

截取部分如下:

5.4 关注感兴趣的模块,导出基因进行GO分析

GO结果分析如下:

通过与上面的几个图表配合,发现EAE鼠与炎症通路/免疫相关,而新生鼠的胶质细胞则是cell cycle/胶质细胞分化/神经细胞发育/轴树突形成通路相关。与原SCI分析相符,与预期相符。

如下:

5.6 提取指定模块的基因并做热图

都挺好的。

点评:这个热图有问题,具体代码是  n=scale(t(dat+1)) 里面少了一个转置!

如图:

6. 模块导出

感兴趣的模块导出到cytoscape,VisANT等软件进一步进行可视化分析。

       至此,复现结束。如果你仔细的看到了这里,说明你是想学WGCNA的了。回到课题本身,是否对小胶质细胞的认识更近了一步?提个小小的科学问题:在PD中,是否有一个胶质细胞亚群可对MPP+诱导的黑质神经细胞死亡有抵抗和保护作用?哈哈,别说我是搞肿瘤的了。。。

       这些内容,换个思路应该够一个硕士毕业了。。。

       写完又是深夜【捂脸】。还在持续学习中fighting。。。

能跟下来这篇教程的前提是你学习过R语言,否则一切都是镜中花水中月!

手机投屏到智能电视 你知道哪几种方法?

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